Variasi konsentrasi ekstrak etanol kulit batang manggis. 2. Variabel terkendali :
DPPH sebagai senyawa radikal bebas, alat, kualitas bahan simplisia. 3.Variabel
...
BAB III METODE PENELITIAN
A. Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Biologi Farmasi dan laboratorium Kimia Analisis, Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Purwokerto.
B. Variabel Penelitian Variabel yang digunakan dalam penelitian ini adalah : 1. Variabel bebas
: Variasi konsentrasi ekstrak etanol kulit batang manggis
2. Variabel terkendali
: DPPH sebagai senyawa radikal bebas, alat, kualitas bahan simplisia.
3.Variabel tergantung : Potensi antioksidan ekstrak etanol kulit batang manggis terhadap radikal bebas DPPH.
C. Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam penelitian ini : alat penyerbuk, maserator, beker glass (Pyrex) dan alat gelas lainnya, spektrofotometer UV
( Shimadzu UV-1201), mikropipet.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini : metanol p.a (Merck), DPPH (diphenylpicrylhidrazyl) p.a (Sigma), vitamin E (Natur E). Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak etanol kulit batang manggis.
D. Prosedur Penelitian 1. Determinasi tanaman Determinasi dilakukan di Laboratorium Botani dan Genetika, Jurusan Pendidikan 14 Biologi FKIP Universitas Muhammadiyah Purwokerto.
2. Penyiapan Bahan 13
Kulit batang manggis diambil di Desa Rawaheng, Kecamatan Wangon Kabupaten Banyumas, Jawa Tengah, dengan usia pohon manggis sekitar 10 tahun. Pengeringan kulit batang manggis dilakukan dengan ditutup kain hitam supaya tidak terkena sinar matahari langsung. Setelah itu dijemur dibawah sinar matahari sampai kering. Simplisia yang telah kering (dengan memperhatikan persyaratan kandungan air maksimal dalam simplisia) diserbuk dan diayak menggunakan ayakan dengan no mesh 40/60, kemudian ditempatkan dalam botol coklat yang kering. 3. Pembuatan ekstrak etanol kulit batang manggis Ekstrak dibuat dengan cara pengadukan dan remaserasi dengan menggunakan etanol 70%. Sebanyak 500 gram bagian serbuk kulit batang manggis dimasukkan ke dalam maserator, ditambah 10 bagian etanol 70%, direndam selama 6 jam sambil diaduk berkalikali (Anonim, 2004). Maserat dipisahkan dan proses diulangi 2 kali dengan jumlah pelarut yaitu 4 bagian etanol 70% dari bobot simplisia awal. Semua maserat dikumpulkan dan diuapkan dengan menggunakan bantuan penangas air dan kipas angin, hingga diperoleh ekstrak kental, ditimbang dan dicatat rendemen yang diperoleh (Anonim,1986). 1. Pembuatan Larutan Stok Ekstrak Etanol Kulit Batang Manggis Konsentrasi 2000 ppm Larutan stok dibuat dengan cara menimbang seksama 0,1 gram ekstrak etanol kulit batang manggis dilarutkan dalam 50 mL metanol p.a. 2. Pembuatan Seri Konsentrasi Ekstrak Etanol Kulit Batang Manggis Dari larutan stok dengan konsentrasi 2000 ppm dipipet sebanyak 0.5; 1; 2; 4; mL dimasukkan dalam labu takar 10 mL dan ditambahkan dengan metanol p.a sampai dengan tanda, sehingga diperoleh konsentrasi 100, 200, 400, dan 800 ppm. 15 3. Pembuatan Larutan Stok Vitamin E Konsentrasi 1000 ppm Larutan stok dibuat dengan cara menimbang seksama 0,05 gram Vitamin E dilarutkan dalam 50 mL metanol p.a. 4. Pembuatan Seri Konsentrasi Vitamin E Dari larutan stok dengan konsentrasi 1000 ppm dipipet sebanyak 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1 mL dimasukkan dalam labu takar 10 mL dan ditambahkan dengan metanol p.a sampai dengan tanda sehingga diperoleh konsentrasi 20, 40, 60, 80, 100 ppm. 5. Pembuatan Larutan DPPH 0,004%
Larutan DPPH 0,004 % (40 ppm) dibuat dengan cara menimbang 0,01 gram DPPH dilarutkan dalam 250 mL metanol (p.a) tepat pada konsentrasi 0,004 % untuk segera digunakan dan dijaga dalam temperatur rendah dan terlindung dari cahaya. 6. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum DPPH Penentuan panjang gelombang maksimum larutan DPPH 0,004 % untuk uji aktivitas antioksidan ekstrak etanol kulit batang manggis dilakukan sebagai berikut : 5 mL larutan DPPH 0,004 % diamati serapannya pada rentang panjang gelombang 400-600 nm dengan menggunakan blangko metanol. 7. Uji Aktivitas Antioksidan Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan terhadap ekstrak etanol kulit batang manggis dengan seri konsentrasi 800 ppm, 400 ppm, 200 ppm, dan 100 ppm. Pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak etanol kulit batang manggis dilakukan dengan menggunakan metode DPPH. Atom hidrogen atau kemampuan mendonorkan elektron dari ekstrak etanol kulit batang manggis diukur dari hilangnya warna ungu dari larutan DPPH dalam metanol menjadi warna kuning yang jernih. Pengukuran dilakukan 16 menggunakan spektrofotometri. Reagen yang digunakan adalah senyawa radikal stabil DPPH (diphenylpicrylhidrazyl) (Gulluce et al, 2006).100 l dari seri konsentrasi ekstrak etanol kulit batang manggis dilarutkan dalam metanol. Kemudian ditambahkan 0,004% larutan DPPH dalam metanol hingga 10 mL. Jadi masing-masing seri konsentrasi untuk ekstrak etanol kulit batang yaitu 1 ppm, 2 ppm, 4 ppm, dan 8 ppm, sedangkan untuk vitamin Enya masing-masing yaitu 0,2 ppm; 0,4 ppm; 0,6 ppm; 0,8 ppm; dan 1ppm. Setelah diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang, absorbansi dibaca pada λ max menggunakan blanko. Penghambatan radikal bebas dari DPPH dalam persen (I%) dihitung menggunakan rumus I% = (Absorbansi blanko – Absorbansi sampel/Absorbansi blanko) x 100, dimana absorbansi blanko adalah absorbansi dari larutan DPPH 0,004% dan absorbansi sampel adalah absorbansi dari hasil reaksi antara larutan DPPH 0,004% yang direaksikan dengan ekstrak yang diuji. Konsentrasi ekstrak yang menunjukkan 50% hambatan (IC50) dihitung dari kurva hubungan presentase hambatan dengan konsentrasi sampel. Senyawa antioksidan sintetis yang digunakan sebagai kontrol positif adalah vitamin E (Gulluce et al, 2006).
8. Identifikasi dan Profil Kromatografi Lapis Tipisnya Identifikasi golongan senyawa kimia dari profil kromatografi hasil KLT dilakukan dengan cara memberikan pereaksi penampak bercak untuk masing-masing golongan senyawa, hasilnya diidentifikasi dengan melihat warna panampak bercak baik dengan sinar biasa ataupun dengan sinar UV 365 nm. 1. Deteksi flavonoid : Fase Diam
: selulosa
Fase Gerak
: asam asetat 50%
Deteksi
: uap amoniak dan sitroborat
dan berfluoresensi hijau kuning
dengan sinar UV ( Markham,1988). 2. Deteksi tanin
:
Fase Diam
: silika gel F 254
Fase Gerak
: metanol : air (1:1)
Deteksi
17 sinar tampak : FeCl3 1% menghasilkan warna bercak coklat pada dan UV 254nm dan warna ungu pada sinar UV 366nm (Harborne,1987).
E. Analisa Data a. Data yang diperoleh berupa persen penghambatan (I%) dianalisis lebih lanjut untuk mengetahui harga IC50-nya, yaitu menggunakan persamaan regresi linier pada kurva hubungan antara persen hambatan dengan konsentrasi (Gulluce et al, 2006). b. Data yang diperoleh dari pengukuran aktivitas penangkapan radikal bebas berupa IC50 dianalisis dengan SPSS dengan uji t (t test).
