Cultivo ecosostenible de algas marinas

CULTIVO ECOSOSTENIBLE DE ALGAS MARINAS (SEAWEED ECOFRIENDLY AQUACULTURE. SEApanamá)

Memoria PCI C5054/06 Manuales de laboratorio

Dr. Rafael Robaina Romero Dra. Pilar García Jiménez Universidad de Las Palmas de Gran Canaria

MS. Gloria Batista de Vega Universidad de Panamá

2008

El proyecto “Cultivo ecosostenible de algas marinas (Seaweed Ecofriendly Aquaculture. SEAPanamá) es una iniciativa de las Universidades de Las Palmas de Gran Canaria y la Universidad de Panamá, financiada a través de los Proyectos de Cooperación Internacional (PCI) de la Agencia Española de Cooperación Internacional (AECI), como ayuda complementaria C5440/06 para desarrollar durante el año 2007. Comúnmente, los proyectos de investigación se finalizan con la exposición de los resultados y avances logrados productos del mismo. Aunque como acción complementaria no persiguiera objetivos científicos estrictos y tangibles, hemos querido seguir esta misma dinámica para elaborar el presente documento a modo de resumen de actividades desarrolladas y memoria técnica del proyecto C5440/06. Sus resultados han sido lo suficientemente fructíferos como para, yendo más allá de la justificación esperable en una acción complementaria, nos atreviéramos a elaborar este compendio en el que el lector potencial podrá encontrar, la descripción de objetivos, las actividades desarrolladas y manuales inéditos o ya publicados, por los propios autores, acerca de la temática del proyecto: El cultivo sostenible de algas marinas. Esperamos que este documento sirva también a los efectos de justificaciónmemoria técnica del proyecto ante la AECI del Ministerio de Asuntos Exteriores.

Las Palmas de Gran Canaria 10 de enero de 2008

Los autores

2

Contenidos

Proyecto PCI C5054/06

4

Memoria técnica del PCI C5054/06

8

Movilidad Proyectos derivados Experimentos preliminares Participación en congresos Reportaje fotográfico

8 17 31 32 34

Manuales

36

Referencias bibliográficas

99

Anexos documentales

138

3

PROYECTO PCI C5054/06 4

Las algas marinas multicelulares constituyen uno de los más importantes recursos marinos. Su producción anual se estima en dos millones de toneladas, que se usan en la industria alimenticia, como fuente de coloides y productos farmacéuticos; un mercado de billones de dólares. Algunos países han encontrado en el cultivo de las algas una fórmula con la que desarrollar económicamente, pero de forma sostenible las zonas costeras. En estos, las granjas de macroalgas juegan un papel importante en la protección de los ecosistemas litorales, ya que actúa como amortiguadora entre la línea de costa y la tierra firme. Esto lo observamos en el sureste de la India, Caribe panameño o en el Yucatán de México. El cultivo evita el expolio de las poblaciones de algas para el uso industrial, lo que lo convierte en una actividad sostenible. Además, se puede usar para la integración de colectivos indígenas, tal es el caso de los Kunas panameños, o los mayas de la Rivera, cuyas mujeres han encontrado una actividad laboral, al tiempo que la familia recibe ingresos extra por ella. El cultivo abarca el 90% de la demanda de algas, pero sus fundamentos científicos están muy poco desarrollados, si lo comparamos con el conocimiento que tenemos y aplicamos en la agricultura terrestre. La caracterización de entornos acuáticos idóneos para el cultivo de algas depende de factores, tales como las variedades, factores abióticos relevantes, producción, etc., aún están por definir. La producción depende de especies que no han sido seleccionadas, más allá de criterios burdos del tipo de producto obtenible y la productividad alcanzable en relación a otras especies, pero no intraespecíficamente con, por ejemplo, marcadores moleculares. Se siembra y recolecta lo que da la naturaleza, por lo que se está expuesto a la deriva genética incontrolable, las

5

plagas, etc. Se espera que las modernas técnicas de biotecnología puedan contribuir a paliar esta precaria situación de la acuicultura vegetal marina. En este proyecto hemos combinado la experiencia del grupo de Fisiología y Biotecnología de los Vegetales Marinos de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria y la de la Profesora Gloria Batista de Vega, impulsora de la acuicultura vegetal marina en Panamá a través de empresas del tipo Gracilarias de Panamá para, como primeros objetivos dentro de este primer contacto que permite una ayuda complementaria se realizaran, durante las visitas respectivas: -

Cursos sobre cultivos de algas. o Cultivo in vitro en Panamá (curso y taller) o Acuicultura Vegetal en Canarias

-

Preparación de actividades de formación: doctorado para estudiantes de Panamá en Canarias

-

Preparación de proyectos conjuntos de investigación con los que concurrir a nuevas convocatorias de cooperación internacional de España y la EU.

6

MEMORIA DE ACTIVIDADES 7 PCI C5054/06

Visita del Profesor Rafael Robaina Romero a Panamá En cumplimiento del plan de actividades previsto en el proyecto, se realizó una visita a Panamá entre los días 21 a 28 de abril de 2007 (Cuadro 1). Del conjunto de actividades desarrolladas destacamos, por su relevancia: -

La visita cursada al rector

de la Universidad de Panamá, D. Gustavo

García de Paredes el lunes 23 en la que se elaboró un documento base que ha servido para el convenio entre las Universidades de Las Palmas de Gran Canaria y la de Panamá, cuya firma se prevé en breve. -

La visita a la Agencia de Cooperación Española en Panamá, en la que se explicó a sus responsables la naturaleza y objetivos del proyecto

-

La visita a la Autoridad de los Recursos Acuáticos de Panamá (ARAP) en la que se mantuvo una entrevista con su Dirección Doña Adoración León Moruno y cuadro técnico, a los efectos de que, como agencia responsable de la gestión de los recursos litorales de Panamá, apoyaran los proyectos que se pudieran establecer para el desarrollo de la cooperación recién iniciada.

-

Visita a las granjas de cultivo y entrevista

con los responsables de la

empresa Gracilarias de Panamá que ha apoyado este proyecto. -

La conferencia (conversatorio) en la Facultad de Ciencias naturales de la UP y en la sede de la ARAP, en el que se expusieron la bases de la Biotecnología de las algas y sus aplicaciones en Panamá.

-

Conversatorio en el laboratorio Marino de Punta Galeta de la Smithsonian Institution for Tropical Research (SITR) para profesores de secundaria, acerca de las algas como recurso marino y la naturaleza de las Islas Canarias.

8

-

El taller teórico-práctico desarrollado en el SITR (ver reportaje) para estudiantes de postgrado y profesionales en ejercicio en Panamá, en el que se transmitieron los fundamentos prácticos del cultivo in vitro de algas.

-

En la dimensión académica, se tutorizaron los experimentos desarrollados por la estudiante Panameña Claudia Masiel Pérez para la obtención del grado. Claudia Masiel fue becada por la AECI en 2006 para una estancia en nuestros laboratorios de la ULPGC.

-

Se mantuvieron reuniones con estudiantes panameños interesados en realizar el doctorado en Canarias. Algunas de ellas ya han presentado solicitud de beca de doctorado a la AECI (Claudia Pérez y Malurysbel López).

-

Desde la perspectiva científica, se diseñaron los experimentos que la Prof. Gloria Batista debía continuar para evaluar resultados durante su visita a Canarias.

9

Agenda de la visita del profesor Rafael Robaina Romero a Panamá en el marco de desarrollo del PCI C5440/06

10

11

Visita de la Profesora Gloria Batista de Vega a Gran Canaria En cumplimiento del plan de actividades previsto en el proyecto, se realizó una visita a Canarias entre los días 17 a 23 de junio de 2007

(Cuadro 2). Del conjunto de

actividades desarrolladas destacamos por su relevancia: -

La visita a la Vicerrectora Doña Rosario Berriel y al Rector de la ULPGC, D José Regidor García en la que se estrecharon los lazos de amistad e interés en la cooperación entre ambas Universidades.

-

Las conferencias en la Facultad de Ciencias del Mar sobre cultivos de algas en Panamá.

Así mismo, como estaba establecido, se dio un carácter más científico-técnico a la estancia de la profesora Gloria Batista en España, de forma que sirvió para: -

Prácticas de fundamentos del cultivo in vitro. La profesora se integró en las labores del grupo de investigación y, con la ayuda de la Dra. Pilar García Jiménez, aprendió a elaborar medios de cultivo, siembras de explanto, soluciones madre de nutrientes, reguladores de crecimiento. Extracción de ácidos nucleicos y poliaminas.

-

Se diseñó un experimento sobre el efecto de las poliaminas sobre el crecimiento in vitro de explantos de Eucheuma, especie cultivada en Panamá. Algunos de sus resultados se muestran en el anexo documental.

-

Se redactaron las bases de los dos proyectos que continuarán a este que finalizamos y que hemos denominado Seaweed Ecofriendly Aquaculture and Appliccation (SEAppl+i), uno de ellos, que se describe más adelante, fue presentado al PCI de la AECI y ha sido financiado para 2008 con posibilidades de renovar en 2009. Otro se presentará a la Unión Europea en

12

cuanto pueda ser refinado en sus objetivos, y se encuentren socios interesados.

13

Agenda de la visita de la profesora Gloria Batista de Vega a Gran Canaria en el marco de desarrollo del PCI C5440/06

14

15

16

Proyectos derivados del PCI C5440/06 Uno de los objetivos básicos de las ayudas complementarias debe ser consolidar relaciones entre las instituciones participantes. En el desarrollo del presente proyecto se cumplió con el objetivo de elaborar un proyecto más ambicioso que permitiera la continuación de las actividades recién iniciadas. El resultado es el proyecto SEAWEED ECOFRIENDLY AQUACULTURE AND APPLICATIONS, de acrónimo (SEAppl+i). El proyecto ha sido presentado a la convocatoria 2007 del PCI de la AECI, bajo la referencia A7951/07, con éxito ya que ha sido financiado. También se elaboró la ficha básica descriptiva para la construcción de un gran proyecto europeo que pretendemos presentar. Se ha enviado la ficha a varios posibles socios, con mayor o menor éxito. El proyecto europeo se ha convertido en uno de los objetivos del próximo PCI. A continuación describimos los aspectos más relevantes del PCI A7951 así como la ficha de proyecto europeo elaborada para captar socios para el SEAppl+i.

17

18

Antecedentes El proyecto que se presenta es la extensión de una muy fructífera acción complementaria anterior C5054/06 con la que se sentaron las bases de la cooperación científica entre la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria y la Universidad de Panamá. Se pretende ahora consolidar la cooperación en mutua beneficio de las dos instituciones y de la biotecnología y acuicultura vegetal marina, como alternativa ecosostenible en áreas del máximo valor ecológico.

Viabilidad y objetivos

Aunque la cooperación internacional sea un ejercicio de solidaridad, no es menos cierto que el beneficio mutuo puede ayudar a consolidar las líneas de cooperación internacional que se hayan abierto. En Canarias hemos desarrollado una labor modesta pero competitiva en el campo de la biotecnología vegetal marina, centrada en el cultivo in vitro de macrófitos marinos hasta llegar al establecimiento de técnicas moleculares de caracterización y seguimiento de la expresión génica. La acuicultura vegetal en Panamá ha experimentado un gran desarrollo en los últimos años, consolidándose iniciativas empresariales a partir de las primeras pruebas de cultivos de algas (1). Con la acción complementaria C5054/06 desarrollada durante 2007, se establecieron las bases de la cooperación científico y académica entre las dos instituciones (convenio marco establecido) y en particular en el ámbito de la acuicultura marina sostenible y la biotecnología. Fruto de esta cooperación es el proyecto SEAppl+i, por Seaweed Ecofriendly Aquaculture and Applications, que toma su primera forma como proyecto de investigación del PCI, para que sirva como plataforma para el planteamiento de otro más ambicioso a financiar con fondos europeos y en los que se implicarían en un

19

consorcio otras instituciones y empresas latinoamericanas y europeas, con la que ya se han mantenido contactos preliminares. Con este proyecto PCI pretendemos desarrollar cuatro objetivos básicos: I. Identidad genética, que incluye actividades tales como la Caracterización molecular de la especie cultivada y Variabilidad genética en el cultivar mediante la selección y desarrollo de marcadores moleculares. II. Productividad: Establecimiento y caracterización de zonas e cultivo y valoración comparativa de la producción (new site selection), Resistencia a epifitismo. Micropropagación de talos aparentemente (fenotípicamente) resistentes, Caracterización molecular de la resistencia a epifitos mediante el seguimiento de la expresión génica de oxidasas: Desarrollo de sondas para real-time PCR III. Tecnificación: Mejoramiento de métodos de siembra y recolección y, como parte objetivo transversal el de IV. Formación: talleres, seminarios y tesis doctorales.

Metodología y cronograma De acuerdo a los objetivos, exponemos a continuación la metodología a aplicar para el desarrollo de cada uno de ellos. Se prevé que el plan de actividades sea desarrollado durante todo el 2008, debidamente repartido entre los participantes. Entre paréntesis se presentan, a modo de perspectivas, las actividades a desarrollar en caso de renovación del proyecto SEAppl+i para el 2009. I. Identidad genética. (Caracterización de genotipos). Se utilizarán marcadores moleculares que se han citado como útiles para las especies cultivadas como Kappaphycus y Eucheuma que han servido para caracterizarlas genéticamente , genes cloroplásticos como el espaciador entre las subunidades grande y pequeña de la rubisco o la zona codificante de la rubisco grande rbcL, incluso la citocromo oxidasa (cox) (1) .

20

Para el marcaje genético intrapoblacional (en el cultivar) se usarán microsatélites, cuyos cebadores de amplificación se obtendrán comercialmente. II. Productividad (Seguimiento de la expresión en talos resistentes y sensible y durante la infección) El proyecto C5054/06 sirvió para el desarrollo de talleres en los que se establecieron las bases para aplicar las técnicas de cultivo in vitro a las especies cultivadas en Panamá (presumiblemente Eucheuma). Ejemplares de esta especie se han cultivado in vitro en Panamá y Canarias, testándose actualmente el efecto de hormonas vegetales (poliaminas) a los efectos de aumentar la capacidad de propagación. El establecimiento y mantenimiento de clones por regeneración in vitro es ya una realidad. Queda el establecimiento de un programa de selección, para el que hemos elegido el de la sensibilidad al epifitismo, área poco desarrollada a pesar de ser uno de los factores que más condiciona la viabilidad del cultivar y la calidad del ficocoloide obtenido del mismo. Nos basamos en la relación existente entre las poliaminas, su degradación por oxidasas y la relación que existe entre esta y la defensa vegetal, para usarlas como marcador molecular (2), (3). Para la obtención de sondas de expresión se usarán métodos de biología molecular (RT-PCR, iPCR y RACE) ya en marcha en le ULPGC (4).

III. Tecnificación. Casi objetivo transversal es la mejora en los métodos de

siembre y recolección, actualmente muy rudimentarios y basados en una gran inversión en tiempo y mano de obra. Pretendemos la adaptación a modernas técnicas de plantación y recolección que, sin afectar a la mano de obra ya que es un eje esencial de la ECOsostenibilidad del proyecto, disminuyan la inversión en tiempo y que esto redunde en la extensión de las zonas cultivadas . Solo se cultiva una hectárea de las 18 que constituyen la concesión. IV. Formación y Comunicación. Los seminarios y talleres sobre la temática y avances del proyecto se desarrollarán en las visitas de los

21

coordinadores del proyecto. Las tesis doctorales de estudiantes de la Universidad de Panamá se iniciarán con el proyecto mediante la solicitud de ayudas específicas (ej. Becas AECI para el doctorado) con la temática del mismo. Existen ya candidatas para ello: Claudia Massiel Pérez, graduada de la UP y beneficiaria de una beca AECI de corta duración en la ULPGC, Malurisbel López, OTRAS(os). Complementariamente, la Profesora Gloria Batista de Vega, MS por la Universidad de California Berkeley, seguirá el programa de doctorado hasta la obtención del grado de Doctor por la ULPGC. Presentará como trabajo científico sus experiencias en el cultivo de algas marinas en Panamá desarrollado en los últimos años, así como aquellos obtenidos en la aplicación del cultivo in vitro. Las visitas planificadas serán: Gloria Batista de Vega DOS VISITAS y Rafael Robaina Romero (Junio-Julio 2007). Destacar que se pretende la implementación de una web, como plataforma

de comunicación que permita el

contacto permanente durante el desarrollo del proyecto. (1). Zucarello et al. 2006. Systematics and genetic variation in commercial Kappaphycus and Eucheuma (Solieriaceae, Rhodophyta). J. Appl. Phycol. 18: 643-651; (2) Cona et al. 2006. Functions of amina oxidases in plant development and defence. TPS 11: 80-88. Marian et al. (2000)Polyamine in marine macroalgae: natural levels of putrescine, spermidine and spermine in the thalli and change of their concentration during glycerol-induced cell growth in vitro. Physiol. Plant. 110:530-534.(4) García-Jiménez et al. (2007). Control por poliaminas de la reproducción en algas. Proc. Reunión de la SEFV. Alcalá de Henares. España.

Impacto del proyecto para la cooperación española De acuerdo con el plan Director de Cooperación Internacional, al proyecto que se presenta contiene dimensiones de desarrollo que están conformes con las prioridades horizontales y sectoriales encaminadas a aumentar las capacidades económicas (lucha contra la pobreza), por principio básico de cooperación. Aumentar las capacidades para mejorar la sostenibilidad ambiental, al intentar paliar la explotación de las poblaciones naturales de algas y la definición de sitios de cultivo (site culture) en áreas naturales,

22

cuyo estudio permitirá mejor definición y conservación. Se trata de desarrollar un sector productivo de demanda creciente, únicamente posible con las condiciones ambientales de estos países (1). El proyecto implica a Panamá, país preferente de acuerdo al capítulo IV del Plan Director, pero en un futuro incluirá a otros como Marruecos, India y México, también de interés en programas de cooperación.

(1). McHugh (2001). Prospects for Seaweed Production in Developing Countries. FAO fisheries circular 968. p.27.

Adecuación de objetivos y recursos Respecto a los recursos propios, la Universidad de Panamá dispone o tiene acceso a laboratorios para el cultivo de algas (Smithsonian Institutions en Punta Galeta) y a cultivos en zonas de reserva (cultivos de Gracilarias de Panamá en Cativá) con posibilidades de expansión. La Universidad de Las Palmas de Gran Canaria dispone de instalaciones para el cultivo in vitro de algas marinas y todo el aparataje necesario (termocicladores, electroforesis, cámaras de cultivo, etc). Se solicita solo financiación para cubrir los objetivos propuestos y sus actividades, a saber:

Gastos Generales Gastos de viajes ida y vuelta ( 3 x 1400) Seguro médico

4200

(2 x 200)

400

Objetivo I: Identidad genética Consumibles PCR, primers. Secuenciación y obtención de secuencia de primers de zonas de microsatelite

5000 euros

Objetivo II: Productividad Gastos de siembra y seguimiento de cultivos experimentales 23

3000 euros

Cultivos in Vitro en laboratorio de Punta Galeta (Smithsonian Institution)(solo consumibles)

4000 euros

Consumibles para reacción en cadena de la polimerasa, RT, Inversa y Amplificación rápida de terminales de DNA copia (cDNA)

5000 euros

Objetivo III: Tecnificación Acondicionamiento de zonas de cultivo y de la embarcación usada para siembra y recolecta. Zona de almacenamiento, etc. Desarrollo de diseño para la siembra y recolección de algas

7000 euros

Objetivo IV:Formación Ediciones y publicaciones derivadas. Reuniones

1000 euros

Otras ayudas concurrentes Aunque no existen otras ayudas específicas para este proyecto, la modesta aportación conseguida con la ayuda complementaria C5450/06 ha posibilitado que no se parte de cero en cuanto a la pequeña dotación de consumibles necesaria para comenzar lo trabajos de manera casi inmediata. Además, el equipo de la ULPGC dispone de financiación del Gobierno de Canarias (PI2005/140) y del Gobierno de España (BFU2006-06198) que han permitido adquirir la infraestructura y el desarrollo de la metodología necesarias para que el proyecto comience de forma inmediata. En lo que se refiere a infraestructura básica contamos con el apoyo de la empresa Gracilarias de Panamá, aunque serán necesarias algunas implementaciones en material. También, la Smithsonian Institution para las investigaciones tropicales pone a nuestra disposición un laboratorio de propagación in vitro en Punta Galeta (Colón).

24

SEAWEED ECOFRIENDLY AQUACULTURE AND APPLICATIONS

ACRONYMOUS: SEAppl+i

25

Background/Description of problem Nowadays, the seaweed market has grown with prospects to go even further as the demand for the raw materials in food and phycocolloid industry is increasing day-byday. The exploitation of natural population might not sustain industrial requirements as well as it is not a sustainable activity. Thus, algal cultivation may provide a solution to palliate or even substitute in a future for natural resources exploitation. Benefits of algae cultivation are known (recognized) but need more understanding to its properly exploitation: site selection and monitoring, improvements in the algae and optimization of the production of seaweed as commercial crop, and carrageenan quality would provide the utilization of seaweeds as a renewable resources. As an ecofriendly activity, algae cultivation may support the economy of local communities around areas of high natural value, partially satisfies feed to consumers, industries and environmental policy, and contributing to sustainability in the coastal management.

Project profile The SEAppl+i project is mainly a research studying basic problems to improve seaweed cultivation such as the definition and monitoring of the the cultivation site for carragenophytes (Eucheuma-Kappaphycus); definition species and strains for culture; Cell and Tissue Culture Platform to conserve and strain selection and exploratory molecular biology methods to implement in seaweed aquaculture. But it also deals with improving cultivation and recollection methods; postcollection methods towards best carragenan purification and quality as development and innovation programs, and international cooperation since cultivation to supply EU companies is rather only possible outside Europe. The SEAppl+i project is constituted by partners from …..

26

countries, involves experts and scientifics from Europe and Panamá universities and institutions, “government agency” and industries. They are focusing on multidisciplinary skills such as marine plant physiology and biotechnology; coastal management and monitoring services of mariculture activities, producers and purchasing companies that distinguishes the final product quality. The institutions will develop strategies to improve cultivation methods and seaweed, and the development and innovation of post collection and carregeenan purification techniques to ensure production and supply the market with the best carregeenan phycocolloid.

International aspects Seaweed and derived products support an international global market, since populations and cultivation is located in certain areas, whilst the raw material and production is sell to industrialized countries for transformation. SEAppl+i must benefits the caribbean coastal zone of Panama as the producers and EU as consumer, but worldwide use of the knowledge and improvement achieved is expected.

Socio-economic significance SEAppl+i will have the following long-term socio-economic significance: -

To substitute collection for cultural practices with impact in economic depressed and marginal social collectives and ethnic

-

To increase the standard quality of carragenan by reducing costs

-

To preserve mangrove by providing sustainable use of this important ecological habitat

27

-

To generate a model to manage a coastal zone with a monitoring based to improve the quality of life of coastal community

Basic project information Full project title: Seaweed Ecofriendly Aquaculture and Applications

Duration: 60 months

Starting year: 2008-2009

EU funding:

FP7 work-program used: Cooperation (Food, Agriculture and Fisheries, and Biotechnology theme)

Project coordinator: Profesor Dr. Rafael Robaina Romero University of Las Palmas GC Canary Islands Spain

Third country partner: Panamá (a ICPC country) Universidad de Panamá Garcilarias de Panamá

28

SCIENTIFIC SIGNIFICANCE AND OUTCOMES

WORKPROGRAMS

TOPICS

Research

- Defining and monitoring the cultivation site for Carrgenophytes (Eucheuma-Kappaphycus) - Defining species and strains for culture - Cell and Tissue Culture Platform to conserve and strain selection - Exploratory molecular biology methods to implement in seaweed aquaculture

Development and

Improving cultivation and

29

innovation

recollection methods Postcollection methods towards best carragenan purification and Quality

International Cooperation (Tele) Prospect and monitoring areas as a new and alternative cultivation sites

-

30

Experimentos preliminares Una vez adquirida la formación necesaria por parte de la Profesora Gloria Batista y sus estudiantes en los talleres y cursos impartidos durante la visita a Panamá del profesor Rafael Robaina,

y

durante la visita a España de Gloria Batista, se

diseñaron experimentos de seguimiento de los efectos in vitro de las poliaminas sobre la especie cultivada en Panamá, Eucheuma sp. (Rhodophyta). Se aprovechó, para ello, la mínima infraestructura de material científico adquirido gracias al proyecto C5440; químicos y material básico de laboratorio al que se le ha dado una utilización más allá de sus uso en los talleres y cursos impartidos. Los resultados obtenidos se presentan en el anexo documental.

31

Participación en congresos El proyecto C5440/06 fue seleccionado por la organización del evento, para su presentación durante el reciente encuentro en Granada (España): Coloquio Internacional de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo”, celebrado entre los días 17 y 18 de diciembre de 2007. Se adjunta el póster elaborado al efecto. Aparte de dar a conocer iniciativas científicas que están sirviendo para el desarrollo en el ámbito de la Cooperación Internacional, este coloquio tenía como objetivo la selección de proyectos para una exposición internacional itinerante por los museos de la Ciencia europeos. Confiamos que nuestro proyecto sea seleccionado también para participar en tal iniciativa.

Aceptación del Proyecto SEAppl+i para participar en el coloquio de Granada 2007

32

Cartel presentado en el coloquio internacional de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo. Granada (España) 2007

33

Reportaje fotográfico

Curso-taller sobre cultivo in vitro desarrollado en Punta Galeta (Colón, Panamá).

34

Cultivos de macroalgas en Cativá (Colón, Panamá), pertenecientes a la empresa colaboradora Gracilarias de Panamá

35

MANUALES 36

CULTIVO DE TEJIDOS Y CÉLULAS DE MACROALGAS MARINAS

Introducción

El desarrollo del cultivo de tejidos y células de macroalgas comenzó su andadura en los años 80 con vistas a satisfacer la gran demanda que el cultivo de estos vegetales experimentaba. Los avances obtenidos en Chondrus crispus (Chen & Taylor 1978) y Laminaria angustata (Saga et al. 1978) sirvieron de estímulo a otros ficólogos para obtener y mejorar genéticamente nuevas cepas procedentes de especies de interés económico. En este sentido, la demanda de materia prima, en la industria de la alimentación y la ficología, ha favorecido el desarrollo paulatino en este campo (Sahoo 2000), haciéndose cada vez más necesaria la selección de estas cepas y la puesta a punto de un sistema de cultivo en masa (Sahoo & Yarish 2005). Las técnicas del cultivo de tejidos constituyen, así, una herramienta poderosa para la explotación de las macroalgas a nivel celular (Rorrer & Cheney 2004).

El cultivo de tejidos de macroalgas (STC, Seaweed Tissue Culture) ha avanzado gracias al trabajo con un gran número de especies, no todas de interés industrial, y originado u amplio abanico de técnicas dadas las características particulares de cada una de ellas (Tabla 1). A pesar del retraso comparativo con las plantas superiores, se espera que estas técnicas, junto con aquellas de genética molecular, den el impulso definitivo como el que supuso la era genómica en las terrestres (Waaland et al. 2004, Grossman 2005, Walker et al. 2005).

37

En este capítulo, pretendemos revisar el estado actual del cultivo de tejidos en las algas, dando una perspectiva general de sus logros, problemas y posibilidades. Esta descripción tomará como hilo conductor las pautas fundamentales descritas en las plantas, desde su cultivo a los avances en

biotecnología (Gamborg 2002): i)

Crecimiento del tejido o sus células en medios nutritivos solidificados y/o líquidos; ii) Regeneración mediante los reguladores del crecimiento, fuentes de carbono y formulaciones adecuadas de los medios de cultivo; iii) Modificación genética para la mejora, crecimiento y fusión de protoplastos.

El cultivo de células y tejidos sobre medios nutritivos líquidos o solidificados

En 1978, el trabajo de Chen & Taylor planteó dos nuevos conceptos en el contexto de cultivo in vitro, i) el explanto como una parte concreta del talo que se usa para cultivar y ii) el requerimiento de las condiciones axénicas.

Un explanto es una pieza de tejido extraído del talo con un alto potencial para la propagación vegetativa

A diferencia de las plantas superiores, las macroalgas no poseen organización tisular, presentando diferentes arquitecturas o formas que hacen muy difícil la identificación precisa del explanto. No obstante y fundamentalmente en aquellas macroalgas, rojas y pardas, de interés comercial se ha incidido en la

selección de explantos con

características muy concretas de tamaño (≅ 0.3 cm de diámetro, 5 cm de alto), dependiendo si los que se obtienen son fragmentos discos o cilíndricos (Chen & Taylor

38

1978, Fries 1980, Chen 1982, Saga & Sakai 1983, 1984, Mooney & Van Staden 1984, Polne - Fuller & Gibor 1984, Zuo-Mei 1984, Lee 1985, Bradley & Cheney 1986, Chen 1986, 1987, Fisher & Gibor 1987, Lawlor et al. 1989, Kawashima & Tokuda 1990, Kooistra et al. 1991, Aguirre-Lipperhide & Evans 1993, Sahoo 2001, Yokoya & Handro 2002, Yokoya et al. 2004)). Se sabe además que la procedencia de los explantos afectará a la viabilidad después de los tratamientos de desinfección, a la regeneración e incluso al tipo de estructura regenerada (Fries 1959, Chen & Taylor 1978, Chen 1982, 1986, Polne-Fuller et al. 1984, Zuo-Mei 1984, Cheney et al. 1986, Mooney & Van Staden 1984, Fisher & Gibor 1987). Es más, los explantos procedentes de algas con morfología similar y separados de zonas similares tienen un comportamiento diferencial si son pseudo- o parenquimatosa (Aguirre- Lipperhide & Evans 1995).

Las condiciones de cultivo asépticas se establecen con el uso de antibióticos que actúan sobre la biota asociada

La ausencia de contaminantes es un requisito fundamental para el cultivo in vitro (Steward 1973). Los cultivos axénicos son aquellos totalmente libres de formas de vida extraña o indeseada. Este objetivo, por definición, es difícil de alcanzar ya que los diferentes procedimientos involucran solo una esterilización superficial. En este sentido, Schaeffer (1990) estableció que las condiciones asépticas significan “sin infección u organismos contaminantes”, aderezándose otro matiz, en el caso particular del cultivo de algas, como es el concepto de unialgal, es decir, la ausencia de otras algas.

No obstante, las necesidades de asepsia en el cultivo de tejidos de macroalgas dependerán de los objetos de la propagación. Así en el caso del mantenimiento de un

39

stock de fragmentos e incluso para el abastecimiento de cordeles para la explotación comercial no sería necesario, considerando que las nuevas plantas serán rápidamente colonizadas por bacterias, hongos y otras algas. Por el contrario, si los medios de cultivo se suplementan con alguna fuente de carbono y/o regulador de crecimiento, siguiendo la praxis del cultivo de tejidos para incrementar la tasa de crecimiento, hay que considerar que estos aditamentos también contribuyen a la proliferación ventajosa de otras algas, bacterias, hongos y virus los cuales interfieren en el crecimiento normal de las plantas e incluso las avocan a la muerte.

La obtención de explantos axénicos de macroalgas es un proceso complicado frente a aquel establecido de plantas superiores (Polne-Fuller 1988) y solamente en pocos casos, la completa axenitud se ha logrado (Fries 1980). A priori, se presentan dos inconvenientes considerando i) la ausencia de una superficie externa protectora fácilmente dañable a agentes como el hipoclorito sódico y ii) un aparato fotosintético ubicado en las células más externas y que podría verse afectado, por estos agentes químicos, en la síntesis de carbohidratos necesaria para el sostenimiento del crecimiento. No obstante, los trabajos desarrollados durante el periodo de las décadas de 1960-80, y centrados en el estudio de los efectos de la nutrición sobre la morfogénesis, la mejora de los métodos para el establecimiento de cultivos axénicos o los reguladores de crecimiento (Fries 1963, 1975, Provasoli & Carlucci 1974, Provasoli & Pintner 1980, Tatewaki et al. 1983) han permitido esbozar algunas de las condiciones de partida. De esta manera, se estima que para las formas más simples, de talos multicelulares como Gonotrichum elegans sería necesario una incubación de entre 2-10 d en antibióticos, o tratamientos de ioduro en el caso de de estructuras complejas como Nemalion multidifilum (Fries 1963).

40

De manera general, la asepsia comenzaría con la eliminación de epífitos macroscópicos de la superficie de los explantos, realizada bajo microscopio, con un suave cepillado con pincel o espátula (Xue-Wu & Gordon 1987). Los explantos podrían ser así utilizados o bien se someterían a nuevas etapas de desinfección (Fig 1). El baño de ultrasonidos para eliminar organismos adosados a la pared puede ser opcional, seguido por un tratamiento con un agente químico como esterilizante primario (Tabla 2). Un segundo procedimiento será la utilización de antibióticos para la exclusión del resto de la biota en tratamientos de 1 ó 2 días de duración. Los tipos y concentraciones de antibióticos se seleccionan, siguiendo estrategias específicas y adecuadas (Bradley et al. 1988, Saga & Sakai 1982). Finalizados estos tratamientos, los explantos son cultivados en medios para el control de la esterilidad y que permiten determinar la presencia de los contaminantes remanentes (Polne-Fuller & Gibor 1984). Tras un periodo de 2 semanas, aquellos explantos, libres de bacterias, son transferidos a medio de crecimiento.

Nuestra experiencia nos ha demostrado que es prácticamente imposible obtener cultivos axénicos in vitro de especimenes con una alta contaminación epífita. En esta línea habría pues que considerar estrategias alternativas como el uso de esporas. En Gelidium canariensis, por ejemplo, se puso a punto un método de esterilización forzando la esporulación en medios conteniendo antibióticos y del que se obtuvo sporelings axénicas (García-Jiménez et al. 1999).

41

Explanto

Lavado con agua de mar estéril, 4-5 veces

Eliminación epífitos visibles con pincel, espátula

Lavado con agua de mar estéril (4-5 veces) y baño de ultrasonidos

Enjuague con agua de mar estéril

Tratamiento químico

Chequeo de la esterilidad

Obtención de explantos asépticos y/ o axénicos para cultivo

Diseño simplificado de las etapas de un procedimiento de asepsia.

42

Las macroalgas, axénicas o no, pueden ser propagadas in vitro sin ninguna adición extra independiente de los nutrientes y las vitaminas

Los medios de cultivo empleados en el cultivo in vitro no se desarrollaron específicamente para tales propósitos sino para el estudio de los requerimientos nutritivos de las micro- y las macroalgas (Fries 1959, 1961, 1964, 1973, Mac Lachlan 1977, Woolery & Lewin 1973).

Existen dos tipos de medios de cultivo. Son i) aquellos basados en agua de mar, llamados también medios enriquecidos. Los mejor conocidos son los de Guillard f/2 (Guillard & Ryther 1962), Grund (Von Stoch 1963), PESI (Tatewaki 1966), PES (Provasoli 1968), SWM (McLachlan et al. 1971), TC-1 (Chen & Taylor 1978), SN (Waterbury et al. 1986), PC (Anderson et al. 1997), K (Keller et al. 1987), L1 (Guillard & Margraves 1993), Pro99 (Moore et al 2002), MNK (Noel et al. 2004) y ii) los medios de agua de mar artificial, usados específicamente para algunas especies y con modificaciones en la composición de sus sales. Algunos de ellos son el ASP (Provasoli et al. 1957); SWA (Lee 1985), el Aquil (More et al. 1979, Price et al. 1989), ESAW (Harrison et al. 1980, Berges et al. 2001); ASN-III (Rippka 1988), CCAP (Tompkins et al. 1995), YBC-II (Chen et al. 1996).

El desarrollo de las macroalgas se ve afectado por el medio elegido, no siendo dependiente de la condición del mismo (enriquecido vs.

artificial) pero sí

contrastándose diferencias de crecimiento dentro de aquellos de naturaleza análoga (Fries 1980, Money & Van Staden 1984, Zuo-Mei 1984). Más importante parece ser el estado físico del medio. El medio solidificado, con agar u otros agentes gelidificantes,

43

induce el crecimiento desorganizado similar al callo (Fries 1980, Polne-Fuller et al. 1984, Polne-Fuller & Gibor 1984, Saga et al. 1982, Saga & Sakai 1983, Robaina et al. 1992). En plantas superiores, este fenómeno está relacionado con los efectos del potencial hídrico del medio sobre el crecimiento. El agar contribuye al potencial matricial mientras que la salinidad lo hace sobre el potencial osmótico. Ambos son componentes negativos del potencial hídrico, reduciendo por tanto

la tasa de

crecimiento y pudiéndose manifestar ciertas malformaciones. Estos efectos de las características físicas del medio de cultivo en el crecimiento de las macroalgas fueron también evidenciados por Robaina et al. (1990b) trabajando con tres especies de macroalgas rojas.

La

incidencia de crecimiento desorganizado “espontáneo”, es decir no por

efecto de los reguladores de crecimiento u otras sustancias, y de estructuras tipo callo han sido referenciadas desde el inicio del cultivo de tejidos en macroalgas. Saga et al. (1978) ya describieron la formación de estructuras tipo callo en Laminaria angustata. Chen (1982) indujo estas mismas estructuras en Chondrus crispus cultivado en medio sólido y líquido. La inducción de callo ha sido también observada en Dictyosiphon foeniculaceus (Saga & Sakai, 1982). Fries (1985) recogió la presencia de pelos decolorados en filamentos ramificados de Fucus cultivado en medios agarizados. Polne – Fuller & Gibor (1987) señalaron la formación de callo en zonas de corte y en aquellas expuestas entre la interfase de la superficie sólida del medio y la fase aérea, en más de 20 especies de macroalgas, incluyendo verdes, pardas y rojas. Por otro lado, tres estructuras tipo callo y de regeneración fueron observadas en segmentos del talo de Grateloupia filiformis cultivados en medios de agua de mar enriquecido de Von Stoch: estructuras tipo callo oscuro (CLS, callus like structure) procedentes de células

44

corticales; estructuras CLS claras y estructuras CLS claras y disgregables, ambas de células medulares (Yokoya et al. 1993). Por su parte, Kimura et al. (1997) observaron callos en Undaria undarioides cultivados en medio ASP12-NTA, que generaron esporofitos cuando estos fueron sub-cultivados a medios líquidos. Los explantos medulares del estipe de Laminaria digitata generaron masas tipo “mórulas” en medios PES pero cuando fueron sub-cultivadas con luz blanca continua, ellas crecieron como filamentos y tendieron a disociarse en células esféricas y se establecieron como un cultivo de células filamentosas (Asensi et al. 2001).

Además de la producción de masas desorganizadas tipo callo, las macroalgas muestran también capacidad para crecer organizadamente y desarrollarse sin la adición de reguladores del crecimiento o fuentes de carbono. Así el crecimiento y desarrollo han sido descritos en varias algas rojas como Goniotrichum (Fries 1974), Porphyra (Fries & Iwasaki 1976), Gracilaria (Jennings 1971), estado de conchocelis en Porphyra tenera (Iwasaki 1965), en Polysiphonia y Nemalion (Fries 1973), Agardhiella (Bradley & Cheney 1986), Soleira filiformis (Yokoya & Jandro 2002), Porphyra vietnamensis (Sahoo et al. 2006). Esta capacidad espontánea de propagación vegetativa puede ser también explotada de la misma manera que ya hicieron Dawes & Koch (1991) con propágulos de Kappaphycus.

En conclusión, el potencial para la propagación vegetativa se retiene en cualquier parte del talo, expresándose en la zona de corte de los explantos y consecuentemente estos pueden ser cultivados sin otros requerimientos que los nutrientes minerales y vitaminas. Además el crecimiento desorganizado de las macroalgas puede verse favorecido por la propia anatomía de estos vegetales, no

45

existiendo un inductor químico o físico de estas formas. Estas capacidades de las macroalgas pueden definir una plataforma de técnicas de cultivo in vitro que permita propagar especies para la maricultura o útiles en el diseño de foto bio -reactores (Rorrer & Cheney 2004) y donde la asepsia no sería tan importante, considerando que las fuentes de carbono y reguladores no son imprescindibles.

El cultivo de tejidos y células de macroalgas con reguladores de crecimiento y fuentes de carbono.

Una herramienta biotecnológica ventajosa para el cultivo de tejidos es el uso de sustancias que aseguren el control del crecimiento y desarrollo de las macroalgas. Por escenificar algunos situaciones, el tipo de crecimiento espontáneo, independiente de si es organizado o no, podría ser inapropiado o, las fuentes de carbono favorecerían unas tasas de crecimiento elevadas, necesarias en la transformación de plantas mediante vectores bacterianos (Peña 2005). En esta línea, los reguladores de crecimiento y las fuentes de carbono serían responsables de la inducción de un determinado tipo de crecimiento (organizado vs. desorganizado), su mantenimiento y/o la reorganización en diferentes patrones. Por consiguiente, el esfuerzo debe encaminarse para dar un papel convincente a los reguladores y fuentes de carbono con el fin de optimizar el cultivo de tejidos y células de las algas.

46

La adición de reguladores es necesaria para el crecimiento, la morfogénesis y la formación de callo en ciertas especies.

En contraposición a las evidencias que muestran que ciertas macroalgas regeneran callo sin ningún suplemento, aparte de los propios nutrientes, son numerosos los casos que manifiestan un punto de vista diferente (Tabla 3). En dicha tabla se recogen situaciones donde la inducción de callo y/o regeneración se estimulan por la presencia de reguladores, solos o dependiente de las dosis, en conjunción con las condiciones de cultivo.

En cualquiera de ellas, no obstante, sería necesario determinar los factores que determinan el tipo y la ratio de crecimiento. No hay que olvidar aquellas evidencias de formación de callo a una baja ratio, sin crecimiento autónomo, o con un inicio azaroso de la regeneración, alejadas del papel relevante que tienen los reguladores en el cultivo de tejidos de las plantas (Aguirre-Lipperhide et al. 1995). Este comportamiento y el papel controvertido de los reguladores en el crecimiento de las algas multicelulares, tanto por su importancia a nivel biotecnológico como fisiológico, ha sido extensamente revisado (Bradley 1991, Evans & Trewavas 1991, Aguirre-Lippperhide et al. 1995).

Desde nuestra experiencia, los reguladores de crecimiento tienen un importante rol en el cultivo de tejidos de las macroalgas.

En esta línea de argumentación,

expondremos dos ítems a estudiar i) la competencia celular y ii) el tipo de regulador de crecimiento.

47

La competencia celular se entiende como el status que una célula posee para percibir, traducir y responder a una señal (Osborne & McManus, 2005). Dentro del contexto de las algas y considerando que cualquier parte de ella parece ser competente, este concepto básico, en el cultivo de tejidos, no se ha tenido en cuenta en estos vegetales. Por ejemplo, los explantos de Grateloupia imbricata no se ven afectados por ninguno de los reguladores probados, no ocurriendo lo mismo con las carpoesporas germinadas y sporelings (Robaina et al. 1990 a, b, García-Jiménez et al. 1998).

El tipo de de regulador también será de vital importancia en el cultivo de tejidos. A los comúnmente empleados como las auxinas (2-4D, 2-4 dichlorophenoxyacetic; IAA, indol-3-acetic acid; PAA, phenoxyacetic acid); las citoquininas (BA, benzyladenine; iP, isopentenyladenine; Kin, Kinetin) y giberelinas (GA3, gibberellic acid), se unen otro grupo,

las poliaminas (PAs), de importancia contrastada en los

macrófitos marinos, pero escasamente usadas en el cultivo de tejidos de plantas (Tabla 3). Estas pequeñas moléculas como la putrescina (Put), la espermidina (Spd) y la espermina (Spm) son alifáticas y ubicuas. En plantas superiores, son las encargadas de modular una amplia variedad de procesos fisiológicos como la estabilización de las membranas celulares (Schubert et al. 1983, Roberts et al. 1986, Kaur-Sawhney & Applewhite 1993), la respuesta al estrés (Flores 1990, Aurisiano et al. 1993, Das et al. 1995, Galston et al. 1997, Kakkar et al. 2000) y la senescencia (Slocum et al. 1984, Evans & Malmberg 1989, Rey et al. 1994, Del Duca et al. 2000).

48

En macroalgas, existen datos sobre sus niveles endógenos, de absorción y de transporte a lo largo del talo de Ulva rigida (Badini et al. 1994) y de varias algas rojas y pardas (Marián et al. 2000a). La inhibición de la síntesis de poliaminas en el alga verde Acetabularia afecta de manera directa al desarrollo de fragmentos con y sin núcleo (Brachet et al. 1978). En varias especies intermareales, la acumulación de Put y Spd es el resultado de la respuesta a estrés letal hiposalino (Lee 1998). La adición de DFMO, un inhibidor irreversible de la síntesis de PAs, causa una disminución del crecimiento y la morfogénesis de sporelings de Grateloupia creciendo en medios con glicerol (Marián et al. 2000b). Los niveles endógenos de PAs decrecen en cantidad, desde los estadios infértiles a los fértiles en Grateloupia, correlacionándose además con los diferentes estados de maduración de los cistocarpos en Gracilaria cornea. La Spm también promovió la maduración de los cistocarpos y la consecuente liberación de las esporas en ambas especies de algas rojas (Guzmán-Urióstegui et al. 2002, Sacramento et al. 2004, 2007). En cultivo in vitro, la Spm promovió la formación de callos, mientras que, cuando se combinó al glicerol como fuente de carbono, la regeneración fue favorecida en los cultivos de carpoesporas de Grateloupia (García-Jiménez et al. 1998)

Las fuentes de carbono deben

de estar implicadas en el metabolismo de las

macroalgas y añadidas al medio en condiciones controladas.

La utilización de carbono orgánico para el crecimiento de las microalgas ha sido extensamente documentado (Cheng & Antia 1970, Saunders 1972, Hobbie & Benent 1972, Neilson & Lewin 1974, Lewitus et al. 1991). En el caso de las macroalgas, las diferentes fuentes de carbono orgánico han sido incluidas en los medios de cultivo con mayor o menor éxito en el crecimiento (Polne-Fuller et al. 1984, 1986, Gusev et al. 49

1987, Robaina et al. 1990 a,b, Amano & Noda 1994, Yokoya et al. 1999; Wang et al. 1999, Kumar et al. 2004). De nuevo, este comportamiento indeterminado hace que se cuestione si se requiere fuentes de carbono para el cultivo in vitro (Aguirre-Lipperhide et al. 1995) o por el contrario, se abandone las potencialidades del cultivo hetero- o mixotrófico a favor de estrategias fototróficas (Correr & Cheney 2004). A este respecto, los biotecnólogos apuestan por la adición de carbono cuyo flujo derive a la acumulación de compuestos de interés (Cheng & Johns 1995, Cheng, 1996), haciendo rentable el cultivo frente a aquellas condiciones fototróficas. Como se ha mencionado, ciertas aplicaciones del cultivo de tejidos de macroalgas, como la transformación celular, requiere de altas tasas de crecimiento que solo son alcanzables por el suministro extra de carbono.

Así pues y siguiendo la línea argumental, existen dos cuestiones que se mantienen latentes: una es relativa a la existencia de una fuente de carbono única o ideal y la otra, al por qué aquellas que se presuponen efectivas no promueven ningún efecto. La existencia de una fuente de carbono ideal. Es sabido que la sacarosa es el principal producto que se sintetiza y exporta en plantas superiores, satisfaciendo el crecimiento de las plantas cultivadas. En macroalgas, por el contrario, se adolece de un conocimiento profundo del metabolismo de estos vegetales coadyuvado por ser un grupo altamente heterogéneo, con diferente morfología, fisiología y metabolismo. Con esta necesaria iniciativa que aúne el conocimiento del metabolismo y mejora del cultivo, varios autores han apostado por el glicerol como una fuente de carbono, apropiada en las macroalgas rojas (Robaina et al. 1990 a, b, 1995, Kaczyna & Megnet, 1993, García-Jiménez et al. 1996). El glicerol (1,2,3-propanetriol o glicerina) no sólo difunde a través de las membranas biológicas, sino que, también participa de la

50

regulación osmótica sólo, como en el caso de Dunaliella o, combinado a otros compuestos formando el floridosido o digeneasido (ácido glicérico) (Reed et al. 1980, Reed 1985). En esta línea, el glicerol se respira en los talos del alga roja Grateloupia imbricata cultivados

tras dos horas de incubación previa, y cuya metabolización

promueve un cambio en el perfil lipídico y en las tasas de división celular y de crecimiento (Robaina et al. 1995, García-Jiménez et al. 1996, Ivanova et al. 1999). Fuentes de carbono efectivas a priori que no promueven ningún efecto. Las fuentes de carbono son sustancias osmóticamente activas, cuya adición al agua de mar enriquecida o al medio de cultivo artificial podrían incrementar el potencial osmótico tolerado por una determinada macroalga. Pero además se hace necesario experimentos apropiados de dosis-respuesta que valoren la idoneidad de esa fuente. Se sabe, por ejemplo, que el glicerol no promueve el crecimiento a concentraciones inferiores a 0.1M y 1.0 Osmol K-1 (2.5 MPa) pero si lo hace si se añade a 0.5 M (3.6 MPa). La información sobre las propiedades físicas de las fuentes de carbono y del agua de mar se encuentra en Weast et al.1989.

La mejora genética y las técnicas de cultivo de tejidos de macroalgas.

Si bien los procedimientos genéticos son dificultosos en los vegetales marinos, de complicados y poco conocidos ciclos de vida, se espera que sus aplicaciones contribuyan al desarrollo de la biotecnología algal, con la generación de nuevas cepas o la producción de productos de interés comercial (Waaland et al. 2004, Grossman 2005, Walker et al. 2005), y en las que consecuentemente, las condiciones de cultivo controladas revisten tanta importancia como aquellos criterios relacionados con el avance de la genómica algal (Grossman 2005).

51

La implementación de las modificaciones genéticas en plantas se realizan desde tres aproximaciones i) transformación mediada por Agrobacterium, como el método más efectivo ii) el bombardeo biolístico de partículas y iii) el cultivo de protoplastos (Peña 2005). La metodología para la transformación por Agrobacterium o biolística se lleva a cabo con herramientas del cultivo in vitro (Peña 2005). En primer lugar, la cocultivación de células de las plantas con Agrobacterium, el vector portador del ADN transgénico, resulta en una eficiencia de transformación cercana al 100%. Las células, así transformadas, son seleccionadas por la presencia de agentes como los antibióticos, mientras que, los reguladores de crecimiento y las fuentes de carbono

dirigen y

aceleran el crecimiento (Cheney et al. 2001)

La producción eficiente de protoplastos de macroalgas se ha obtenido por una variedad de protocolos.

La producción de protoplastos se muestra como uno de los campos más prometedores para el progreso de las aplicaciones genéticas. En este sentido, la extensa bibliografía muestra detalladas descripciones sobre el aislamiento, regeneración e incluso hibridación de protoplastos de algas (Millner et al. 1979, Cheney 1986, Polne-Fuller 1988).

En la década de los 90, Fujita & Saito (1990) aislaron protoplastos de especies de Porphyra que fueron fusionadas con métodos de electro fusión y polietilenglicol. Las plantas regeneradas fueron idénticas a una de sus parentales en número de cromosomas y pigmentación. La fusión espontánea de protoplastos fue también observada en Gigartina corymbifera (Gross et al. 1990). Sivan et al. (1992) aislaron protoplastos de

52

especies de Porphyridium, usando una preparación enzimática obtenida de una mezcla de bacterias terrestres. Xing-Hong & Wang (1993) regeneraron plantas completas a partir de protoplastos de Gracilaria asiatica. Estos protoplastos sufrieron las primeras divisiones a los 5-7 d en cultivo, desarrollando masas celulares como callos, que emitieron filamentos desde la periferia y que desparecieron después de un mes en cultivo. En el centro de estas masas surgieron las primeras yemas que, cultivadas con aireación, generaron plantas completas después de tres meses. Alrededor de esta primera planta, se desarrollaron otras, hasta aproximadamente 20 por masa, en apenas cuatro meses. De Porphyra linearis se obtuvieron protoplastos, usando agarasa, los cuales se emplearon como sustitutos de las conchoesporas en el mantenimiento de los cordoles (Chen et al. 1994). Los protoplastos de Porphyra crispata y P. dentata regeneraron pared celular a las 6-8 h, se dividieron y dieron lugar a diferentes patrones de crecimiento y desarrollo según las condiciones de cultivo (Gall et al. 1993). Por su parte, Packer (1994) registró, también en Porphyra, las mayores tasas de viabilidad y productividad de protoplastos. Araki et al. (1994) regeneraron nuevos talos a partir de protoplastos de Bangia atropurpurea, mientras que, Beer & Bjork (1994) estudiaron las propiedades fotosintéticas de los protoplastos, y comparados con los talos de Ulva fasciata, demostraron que aquellos eran capaces de mantener tasas de fotosíntesis tan altas como los talos durante horas. Chen & Chiang (1994) lograron protoplastos de Grateloupia sparsa y G. filicina. Estos excretaron una matriz amorfa como preludio a la formación de la pared celular después de 4 d en cultivo. Uno de estos protoplastos, se dividió después de 7-9 d, formando un disco expandido que produjo un talo erecto o filamentos a los 60 d. Moller et al. (1995) mejoraron la producción y regeneración de protoplastos

53

de Gracilaria verrucosa, usando NaCl como elemento osmótico. Cuando el medio de cultivo alcanzó en 4 d la osmolaridad normal, el 25% de los protoplastos cultivados regeneraron pared celular a los 7 d. Sawabe & Ezura (1996) fueron los primeros en regenerar plántulas de Laminaria japonica, partiendo de protoplastos aislados con alginasa de la bacteria Alteromionas sp., comercialmente disponible como celulasa. Los protoplastos resultantes se cultivaron en medio PES a 5ºC y mostraron pared celular completa a los 7 d, y células en división a los 9. Algunos también fueron capaces de regenerar talos a modo de lámina y estructuras rizoidales después de 30-40 d en cultivo. Los protoplastos de Laminaria japonica fueron cultivados en medios PES e ioduro, en un sistema de flujo continuo. De ellos el 50% regeneraron pared en 24 h, y a los 3 d lo hizo todo el cultivo (Sawabe et al. 1997). Araki et al. (1998) optimizaron los parámetros para el aislamiento de protoplastos de Gracilaria verrucosa. Su método consistió en pre-tratar al tejido con papaina (5 %) a 22º C durante 30 min, y en el uso posterior de agarasa de la bacteria marina Vibrio sp PO-303 con enzimas comerciales. Chen (1998) aisló y cultivó los protoplastos del alga verde Monostroma latissimun, induciendo la formación de filamentos que actuaban como un stock del alga. Los protoplastos, procedentes tanto del pie de fijación como del talo erecto, formaron pared celular a las 5 h y se dividieron entre los días 6 y 9 en medios PES. Las masas de células, los filamentos y/o talos tubulares se formaron a los 14-18 d. Los talos tubulares pudieron desarrollarse como talos en lámina si seguían en cultivo. Kito et al. (1998) fusionaron protoplastos de Monostroma nitidum y Porphyra yeozensis usando polietilenglicol. La frecuencia de fusión, entre los diferentes protoplastos, fue de 1.4% y su tasa de supervivencia entre 2-7% a los 30 d de cultivo, indicando que la recombinación genética era posible entre géneros. Monostroma oxyspermum generó dos formas de crecimiento. Por un lado, los protoplastos

54

desarrollaron pared celular y a continuación esporangios. Estos liberaron esporas que se fijaron y crecieron como talos similares a la planta madre. Por otro, los protoplastos sufrieron divisiones celulares y desarrollaron directamente un talo monostromático. La adición al medio de cultivo de sorbitol, como un agente osmótico, inhibió la división y el consecuente desarrollo. Chen & Shih (2000) desarrollaron protoplastos de Ulva fasciata e indujeron la formación de microtalos en suspensión que fueron empleados como un stock. Russing & Cosson (2001) regeneraron protoplastos de Enteromorpha intestinales y también los usaron como stock para el cultivo. Uppalati & Fujita (2002) aislaron y regeneraron protoplastos de especies como Monostroma, Enteromorpha y Ulva.

Así pues y dada la enorme cantidad de información sobre aislamiento y regeneración de protoplastos existente, a continuación se detallará una selección de ítems importantes para su consecución a la vista de su utilidad en el cultivo de tejidos de macroalgas.

El asilamiento de protoplastos y su cultivo depende de la selección apropiada de determinadas condiciones que incluye el tipo de tejido, la limpieza, pre-tratamiento, las enzimas.

A priori, el mejor material para el aislamiento de los protoplastos es el tejido joven sin estructuras reproductoras. Los especimenes pueden proceder de la naturaleza (Chen 1986, 1987, Gross 1990, Reddy et al. 1992, Chen 1998, Keverkordes et al. 1993) o del laboratorio, cultivados bajo condiciones controladas de luz y temperatura (Björk et al.

55

1990, 1992, Araki et al. 1994, 1998). Las condiciones asépticas son imprescindibles, ya que, normalmente todos los procedimientos introducen una fuente de carbono, como osmótico, favoreciendo por consiguiente el crecimiento desmesurado de contaminantes sobre las células. Así pues, los talos son desinfectados usando los procedimientos comunes ya descritos (Chen 1986, 1987, 1989, Liu et al. 1992, Gall et al. 1993, Coury et al. 1993).

Pre-tratamiento del tejido.

La bibliografía recomienda un pre-tratamiento del tejido antes de su incubación en un cóctel enzimático apropiado para la obtención de protoplastos. El más simple se refiere al cultivo en oscuridad, durante unas horas (Cheney et al. 1986). Otros, por el contrario, aluden a la inducción de pre-plasmolisis, incubando el material en unas solución de agua de mar hiperosmótica (Rodde et al. 1997) o pre-plasmolisis combinada con la adición de agentes quelantes, tipo EGTA, que facilitan la digestión de la pared celular (Butler et al. 1989, Kloareg et al. 1989, Kevekordes et al. 1993). La papaína se ha incluido, en ciertas ocasiones durante este tratamiento, para facilitar el reblandecimiento del tejido (Waaland 1990, Gall et al. 1993, Chen et al. 1994, 1995, Araki et al. 1998,), y sus efectos tóxico, propios de la exposición continuada, controlados con la adición de BSA, sulfato dextrano o PMSF (Gall et al. 1993).

Digestión enzimática del tejido.

Dada la composición heterogénea de la pared celular de las diferentes especies de algas, generalmente se usa una mezcla de enzimas. Así, la Onozuka R-10 (1-4%) se emplea

56

para degradar la celulosa y hemicelulosa, ya que, tiene ciertas cantidades de hemicelulasa (Cheney 1986, Chen LCM 1987, 1989, Böjrk et al. 1990, Gall et al. 1993, Chen LCM et al. 1994, Chen YC 1998). La Driselasa y Onozuka RS han sido utilizadas también como sustitutos en algunos casos (Fisher & Gibor 1987; Araki et al. 1998). La digestión de compuestos peptínicos se consigue con Macerozyme R-10 (4% p/v) (Cheney et al. 1986, Bjork et al. 1990, Gross 1990, Mejjad et al. 1992, Gall et al. 1993, Chen LCM et al. 1995, Araki et al. 1998). Para otros componentes específicos, se trabajó con mezclas complejas de enzimas extraídos de diferentes herbívoros marinos. En este sentido, Littorina littorea ha sido empleada para la obtención de protoplastos de Porphyra (Chen LCM 1986, 1987, 1989), el Abalone en Porphyra spp. (Polne-Fuller et al. 1986, Waaland et al. 1990), y especies de Gracilaria (Björk et al. 1990), Grateloupia spp (Chen LCM et al. 1994), Palmaria palmata (Liu et al. 1992) y el alga verde Ulva spp (Reddy et al. 1989, Björk et al. 1990) y, los extractos de Aplysia vaccaria se usaron en el alga parda Macrocystis pyrifera (Kloareg et al. 1989). Más recientemente, estas mezclas han sido sustituidas por actividades de enzimas puras como la Agarasa para las algas rojas (Araki et al. 1998) y Alginato-Liasa para las paradas (Rodde et al. 1997).

Otros factores que afectan a la producción y viabilidad de los protoplastos son las sustancias que acompañan a cualquier reacción enzimática, esto es, la presencia de toxinas y actividad proteasa y ribonucleasa no recomendable (Butler et al. 1989); la temperatura (16-26 ºC); las condiciones de oscuridad y agitación y el tiempo de incubación (1 -24 h). El MES es el tampón más habitual para estabilizar el pH durante la digestión así como, las sales de calcio como protectoras de la membrana (Chen LCM 1987). Como osmóticos, previsores del hinchamiento y encogimiento de las células tras la pérdida de la pared, suele emplearse el manitol o sorbitol en concentraciones de 0.5-

57

1 M. Atendiendo a Raven (1984), las condiciones osmóticas en el interior de una célula algal son de 1-1.3 Os Kg-1 (2.2-2.9 Mpa) por lo que, la concentraciones de estos compuestos deben ser suficientes para que la célula no sufriera modificaciones extremas.

Finalmente, la ausencia de pared celular en los hipotéticos protoplastos, así como, su viabilidad es valorada con la tinción de Blanco-Calcofluor (CFW) y el diacetato de fluoresceína (FDA) como tinte vital, respectivamente. La rotura de las células en solución hipoosmóticas es también un test aceptable para la viabilidad (Waaland et al. 1990), aunque indudablemente el crecimiento y la regeneración de estas células es la mejor señal. La cuantificación de la producción de protoplastos puede realizarse con un hemocitómetro.

Aislamiento y cultivo.

El aislamiento de los protoplastos se realiza, comúnmente, filtrando la mezcla de digestión por una malla de nylon de aproximadamente 25-200

m de luz de poro que

favorece la retención de agregados celulares y otros restos. A continuación, los protoplastos son centrifugados a 50-200 g y el sedimento obtenido se cultiva en un medio. Otra alternativa descrita para la separación de estas células, se refiere a la centrifugación en un gradiente con Percoll o Ficoll, sustancias no osmóticamente activas, de la mezcla de digestión (Gall et al. 1993). Los medios de cultivo comunes en el cultivo de protoplastos son los mismos ya descritos para el cultivo de tejidos (i.e. TC en Chen LCM, 1986, 1987, 1989; f/2 en Waaland et al. 1990; PES en Mejjad et al. 1992; Chen YC, 1998; ASP en Araki et al. 1998) excepto por la adición del osmótico y

58

antibióticos que contribuyen a prevenir la contaminación (Waaland et al. 1990, Gall et al. 1993, Rodde et al. 1997).

En conclusión, en estos años se ha desarrollado y puesto a punto una notable cantidad de protocolos que nos permiten seleccionar y definir el tipo de explanto y, cultivarlo axénicamente en medio enriquecido y/o artificial. Los resultados han abarcado desde la propia regeneración a la formación de callo, en ausencia de reguladores de crecimiento y, como consecuencia de la capacidad de propagación intrínseca, la anatomía de los talos y/o las condiciones físicas del medio de cultivo.

Con este bagaje, el cultivo de tejidos de macroalgas podría enfrentarse a ciertas aplicaciones biotecnológicas como la propagación clonal para la maricultura, o el uso de protoplastos en la genómica de estos vegetales aunque ahondando aún en el control exhaustivo del crecimiento y desarrollo y el papel de los reguladores y las fuentes de carbono. Para resolver estos tópicos apuntamos la introducción de reguladores efectivos como las poliaminas, la selección de células competentes y/o el ajuste en los medios de cultivo, con la adición de fuentes de carbono compatibles con el metabolismo algal.

59

60

DESARROLLO METODOLÓGICO PARA LA IMPLEMENTACIÓN DEL CULTIVO IN VITRO DE EUCHEUMA

El cultivo in vitro de algas es un método de propagación bajo condiciones estériles, aprovechando la totipotencialidad de las células para dar lugar a plantas completas. Las células totipotentes son células somáticas capaces de dividirse y diferenciarse si se cultivan en un medio apropiado. Esta herramienta de cultivo presenta las ventajas de i) la propagación de gran cantidad de material vegetal en un tiempo inferior a las condiciones naturales; ii) el manejo de las mismas en espacios reducidos, como puede ser el laboratorio y iii) la obtención de plantas libres de patógenos y control de ciertos productos de interés industrial.

Básicamente el cultivo in vitro o la micropropagación, que es una de las aplicaciones más frecuentes (Esquema 1), consiste en tomar un fragmento o una porción pequeña de talo, denominado explanto, y disponerla en medio nutritivo, para obtener una descendencia uniforme. Este medio puede ser, a su vez, líquido o sólido. Esta técnica implica un cierto control del entorno físico y químico de la planta, ya que, no solo hay que mantener las condiciones del entorno natural, sino también, suministrar aquellos requerimientos que antes obtenía del individuo completo.

61

Propagación in vitro de un fragmento de alga.

62

Plantearemos este capítulo sobre el desarrollo metodológico del cultivo in vitro, en dos fases de trabajo, con los requerimientos necesarios en cada uno de ellas, para abordar con éxito un protocolo de propagación:

I. FASE PREPARATIVA nos permitiría conocer cuáles son las condiciones de asepsia necesarias y cómo conseguirlas, así como, de la preparación de los medios de cultivo. Con ello abordaríamos las etapas del cultivo in vitro relacionadas con: Establecimiento de las condiciones de asepsia. Preparación de la planta madre. Siembra o introducción del material en los recipientes.

II. FASE DE MANTENIMIENTO nos centraríamos en los tipos de explantos que se pueden seleccionar y qué factores afectarían al cultivo. Las distintas ratios de hormonas indicaría el tipo de crecimiento que se vería favorecido. In vitro incluiría las etapas de: Multiplicación de los explantos. El enraizamiento, si se tratase de plantas superiores. Aclimatación ex vitro.

63

El establecimiento de la asepsia es un requerimiento indispensable en el cultivo in vitro

De manera general, el desarrollo metodológico para la limpieza, desinfección y esterilización de los utensilios, material vegetal y medios de cultivo está basado fundamentalmente en la transmisión de pautas de comportamiento por parte de los científicos. En este capítulo, nosotros deseamos plantear, desde nuestra propia experiencia, los principios y mecanismos básicos que han funcionado en el laboratorio de Fisiología y Biotecnología Vegetal Marina de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, con la única finalidad que sirva para la futura elaboración de protocolos específicos. Como punto de partida, debemos entender que la limpieza es el principio básico para una perfecta esterilización. Los objetivos fundamentales de la limpieza son i) reducir la carga microbiana mediante la separación o movilización de la suciedad desde las superficies inertes (vidrio, cámara de flujo, cámara de cultivo) la cual actuaría como soporte físico o sustento nutritivo a los microorganismos; ii) permitir el contacto óptimo con el desinfectante, y iii) prevenir el deterioro de las zonas de trabajo y material. La manera más simple: el uso del detergente.

El modus operandi de un detergente es disminuir la tensión superficial del agua, favoreciendo un mayor contacto de ésta con la superficie a tratar, y por consiguiente, la eliminación de las partículas de suciedad de las superficies sólidas. Brevemente, esta forma de actuar se debe a la naturaleza anfótera del detergente, es decir, este es una molécula con una parte liposoluble o soluble en disolvente apolar y otra, hidrosoluble o soluble en agua o disolventes polares. Esta solubilidad para distintas moléculas le

64

permite ocupar la interfase y remover distintos tipos de partículas. A efectos prácticos, los detergentes moderadamente alcalinos, pH 8-12, son los más eficaces, ya que a la capacidad tensoactiva aportada, se unen ingredientes no espumantes y no adsorbentes. En el mercado existen numerosos productos con estas características y cuyo uso debe hacerse atendiendo a las recomendaciones del fabricante. Como ejemplo, los diferentes productos de desinfección de Decon Laboratories (marca registrada, UK) son apropiados para nuestros propósitos. En cualquier caso, un detergente para lavavajillas diluido al 0.5-1% también puede servir si nos aseguramos que no queden restos de jabón en el último lavado. Por último una consideración sobre la forma de realizar la limpieza manual. Una vez enjabonadas y aclaradas las zonas de trabajo y/o instrumental, éstas deben ser secadas perfectamente previo a la esterilización. La presencia de gotas actúa como una barrera protectora sobre las bacterias y conlleva, aunque no perceptible, una defectuosa esterilización.

La desinfección es una técnica cuyo objeto es la destrucción de microorganismos, evitándose la propagación de los mismos

Sensu stricto, la desinfección se corresponde con la eliminación de aquellos organismos depositados sobre material inerte, mientras que, la misma técnica aplicada sobre tejido o material vivo se denomina antisepsia. Considerando que los antisépticos son un tipo de agente desinfectante, en este trabajo hablaremos de desinfección como una manera de simplificar el desarrollo metodológico del cultivo in vitro.

65

La estrategia general a seguir, se basa en someter al material vegetal a varios agentes desinfectantes de tipo físicos (pincel, baño de ultrasonidos) y/o químicos (agentes orgánicos e inorgánicos, antibióticos), para eliminar paulatinamente todos los organismos asociados al talo de las algas. Estos tratamientos de desinfección presentan dos hándicaps. Por un lado, hay que llegar a un compromiso entre la concentración del agente desinfectante y el tiempo de contacto con el material: los agentes también pueden dañar los tejidos pero, a medida que disminuimos su presencia en cantidad o duración, estamos favoreciendo el crecimiento de microorganismos. Por otro lado, la presencia de endófitos en el interior del tejido vegetal no se elimina con ninguno de los procedimientos mencionados, pudiendo proliferar durante el cultivo. El material recogido directamente de la naturaleza, aunque seccionado y tratado en el laboratorio bajo condiciones controladas, conlleva un cierto riesgo de contaminación intrínseca. En este sentido y, siempre que se pueda, es mejor utilizar fragmentos o explantos procedentes de plantas

aclimatadas en acuarios y creciendo bajo condiciones

controladas. De no ser así, se recomienda recolectar individuos, con un alto grado de pigmentación y bajo epifitismo. Para su transporte, se debería agrupar en bandejas de plástico o aluminio con papel, previamente humedecido en agua de mar, en el fondo de las mismas. Una vez en el laboratorio, las algas se limpiarán con pincel para arrastrar restos de sustratos y/o epífitos y se pasarán por un baño de ultrasonidos

66

Eucheuma sp. mantenida en el laboratorio como fuente de material para el establecieimto del cultivo. Acuario de 30 litros, medio de cultivo PES y 30 ºC de tempertaura regulada mediante termostato.

Los ultrasonidos generan ondas de alta frecuencia que dan alternancias de presión y depresión, consiguiéndose desprender de las paredes del talo de las algas a bacterias y epífitos. Los explantos se colocan en el interior del sistema de ultrasonidos, dispuestos en un recipiente con agua de mar estéril y totalmente sumergido en agua destilada. Después de cada baño, es recomendable un aclarado y nuevo lavado con agua de mar para eliminar los restos desprendidos.

Como aproximación, tres lavados de 1.5 minutos con intervalos de aclarados de aproximadamente 1 minuto es un buen procedimiento para algas rojas. Baño sonicador para la limpieza mecánica de explantos

La desinfección conlleva también el uso de agentes químicos (Esquema 2), reduciendo o destruyendo la capacidad infectadora de un microorganismo pero no necesariamente de la gran mayoría de ellos. En general, el material vegetal se somete a la acción de un agente esterilizante primario que coadyuvará positivamente en la acción de los agentes secundarios.

Como agentes primarios destacan la polividona yodada (BetadineTM, solución comercial) y el bromuro potásico, eficaces contra las bacterias, los hongos, los virus y los protozoos o, el etanol con actividad bacteriana contrastada, ya que, desnaturaliza a las proteínas, disolviendo las capas lipídicas.

67

Las sales de hipocloritos, aunque no son catalogadas como un antiséptico propiamente, se han usado en la desinfección de material vegetal. La fuente más utilizada de hipoclorito de sodio es la lejía, la cual contiene aproximadamente un 5% de hipoclorito de sodio como agente activo. En este sentido, se puede preparar una solución acuosa entre 10-20% (v/v) de lejía, debiéndose renovar a las 24 h. Como halógenos que son, el Bromo, el Iodo o el

Cloro, actúan como agentes

fuertemente oxidantes por lo que son altamente reactivos y destructivos para los componentes vitales de las células microbianas. La desinfección se realiza por inmersión del material vegetal en estas soluciones por un tiempo nunca superior a 15 minutos.

Nuestra experiencia revela que un tratamiento con polividona yodada al 7% con unas gotas de detergente Tween 80, como tenso activo, durante 5 minutos, es suficiente para favorecer la posterior acción de la solución de antibióticos en macroalgas rojas.

Procedimento hasta la puesta en cultivo de explantos del talo

68

En la Tabla 1, se expresan los diferentes agentes desinfectantes utilizados, en nuestro laboratorio, para el cultivo de vegetales marinos y que dieron resultados positivos. Hay que considerar que los tiempos y las concentraciones expuestas son el resultado de nuestra propia experiencia. Cualquier acercamiento con otro tipo de material o agente debe considerar la naturaleza de los microorganismos a eliminar, la fase de crecimiento y/o, la presencia de estructuras de resistencia. Tabla 1. Agentes desinfectantes (físicos y químicos) utilizados en el cultivo in vitro de diferentes especies de macroalgas. PROCEDIMIENTO DE DESINFECCIÓN FÍSICO Lavado con agua Elimina por choque corriente. osmótico a pequeños 1-2 min organismos. Cepillado del Arrastra partículas material. incrustradas como piedrecitas, conchas. Baño de Desprende bacterias y 3 x 1.5 min ultrasonidos. epífitos QUÍMICO Agentes desinfectantes Polividona Yodada primarios KBr

Bactericida, anti- 7%, 5 min. (fúngico, protozoos y víricos). 2%, 5 min ídem

HClO4

ídem

Etanol

Bactericida.

10-20%, 5-10 min 70-80%, 5-10 min

Agentes desinfectantes secundarios Antibióticos de Bactericidas de amplio amplio espectro espectro. Se emplean en una Germanio GeO2, anti-diatomeas. solución combinada Nistatina Anti-fúngico. 69

Los agentes químicos secundarios más comunmente empleados en algas son los antibióticos de amplio espectro, junto con compuestos anti-fúngicos y antidiatomeas. Los antibióticos pueden detener y ralentizar el crecimiento de los organismos, son los llamados de acción bacteriostática, o bien destruirles –acción bactericida-. Los más usados son la penicilina, la estreptomicina, la ampicilina y la nistatina. Tienen efectos aditivos y sinérgicos en referencia a su acción. La penicilina tiene actividad bacteriana contra gérmenes gram positivos y negativos. En ausencia del compuesto como tal puede usarse, en su defecto, la penicilina G sódica, cristalizada en dosis de 1000000 de unidades, dispensada en farmacias. Las ampicilinas tienen actividad similar a la penicilina pero agregan actividad sobre otras poblaciones de bacterias gram negativas.

En la Tabla 2 se recogen los agentes secundarios comúnmente empleados y su espectro de acción. Se preparan como una solución madre en agua destilada para evitar su inactivación por efecto de las sales, y mantienen una actividad máxima aproximada de 3 meses si se conservan en nevera. La desinfección se lleva a cabo con la incubación individual, en tubos de cultivo, de cada explanto en la solución de antibióticos en una ratio de 1 solución antibióticos: 9 agua de mar estéril (v/v) durante 5 días.

70

Tabla 2. Solución de agentes secundarios utilizada en la desinfección de explantos de diversas algas rojas.

Cantidad (mg) Penicilina

Bactericida gram +/- 100

Ampicilina

Bactericida gram -

25

Nistatina

Fungicida

25

Dióxido de germanio

Anti-diatomeas

10

Agua destilada filtrada y esterilizada

100 mL

Tomar 1 ml y añadir a 9 mL de agua de mar estéril.

La manipulación del material vegetal, para la obtención y siembra de explantos, debe realizarse en una campana de flujo laminar, y con las manos lavadas con jabón y enjuagadas con etanol, como una manera de contribuir positivamente a la desinfección. Esta campana se caracteriza por el flujo continuo, no turbulento, de aire estéril. Este entorno se mantiene así, gracias a la acción de filtros ubicados en la parte superior o frontal de la cabina, que filtran el aire que circula en el interior, durante todo el tiempo de procesado, eliminando cualquier partícula extraña. El aire del exterior no puede entrar en la cámara de flujo sin pasar previamente por los filtros, ya que, la presión dentro de la cámara es ligeramente superior al exterior, favoreciendo que el aire siempre circule de dentro hacia fuera y nunca al revés.

71

La ubicación de los filtros determinará los tipos de cámara de flujo. Si los filtros se ubican en la parte frontal, la corriente de aire se genera desde el fondo de la cámara hasta el frente, de forma que las partículas se mueven horizontalmente a la superficie de trabajo. Cuando aquellos están en la parte superior, el flujo se produce desde el techo hacia la superficie de trabajo de forma que las partículas se trasladan perpendicularmente a ella. Este es el tipo de cámara que se usa en cultivo bacteriano frente a las primeras, más apropiadas para el cultivo de tejidos.

La mayoría de las cámaras de flujo se ven optimizadas con la incorporación de fuentes de luz UV. La incidencia de luz UV durante un periodo determinado de tiempo (c.a. 30 minutos) previa a la manipulación, favorece que cualquier ADN quede inactivado irreversiblemente. Por consiguiente se expone bajo esta energía, todo aquel instrumental que no puede ser esterilizado por autoclave: placas de cultivo de plástico, pinzas, bisturís, cinta parafina para el sellado de placas. La radiación UV más efectiva se realiza con una longitud de onda de 254 nm. En el caso particular de la manipulación de pinzas, bisturís y asas de siembra, además son sometidos a flameado bajo una llama de un mechero de alcohol o tipo bunsen, hasta que se ponen al rojo. Todo este instrumental está dispuesto dentro de la cámara de flujo, en un recipiente con etanol. Esto supone una esterilización momentánea durante el manejo del material vegetal. Es importante reseñar que cuántas más precauciones, mejor será nuestro resultado. En este sentido, un objeto puede estar desinfectado pero no esterilizado, mientras que todo material estéril está desinfectado. Transcurrida esta etapa, el grado de desinfección de los explantos puede chequearse en medios de control durante 10 días. La composición de este medio se recoge en la Tabla 3.

72

Tabla 3. Composición del medio de control de la desinfección de los explantos. *

La composición del medio Provasoli (PES) está referenciada, más adelante, en medios

de cultivo.

Cantidad (mg) Glucosa

50

Sacarosa

100

Hidrolizado de caseína 50 Lactosa bacteriológica

100

Medio Provasoli *

100 mL

La esterilización es una técnica mediante la cual destruimos cualquier forma de vida, incluida sus formas de resistencia

El procedimiento para la eliminación de microorganismos en medio de cultivo y el material de vidrio es una esterilización en autoclave, denominada también por calor húmedo, bajo presión de 1 atmósfera y alta temperatura (121º C). Esta actividad se desarrolla en 3 periodos:

•

Una primera etapa, denominada de purgado, en la cual la temperatura ascenderá hasta que todo el interior del autoclave alcance la temperatura de esterilización deseada. Puede llevar alrededor de 1 hora.

73

•

Una segunda fase será el período de mantenimiento o de esterilización propiamente. La esterilización del material de vidrio suele llevar periodos de tiempo entre 4060 minutos, mientras que, veinte minutos será suficiente pare el medio de cultivo, previniendo así la precipitación de ciertas sales. Por razones obvias, en el autoclave no se pueden introducir sustancias como antibióticos, enzimas, extractos vegetales, reguladores de crecimiento etc., ni tampoco recipientes que no soporten altas temperaturas.

•

Finalmente, el período de enfriamiento o de descarga implica la disminución de la presión, el cual puede llevar aproximadamente otra hora. Esta fase se realiza gradualmente para prevenir la rotura del material de vidrio como consecuencia de un descenso demasiado rápido de la temperatura.

El desarrollo práctico de la esterilización por autoclave se basa en disponer los líquidos en recipientes de doble capacidad al volumen a esterilizar. La eficacia del proceso dependerá de este volumen, ya que, i) la transmisión de calor se producirá desde el exterior hasta el interior del recipiente y ii) con el aumento de la temperatura el líquido bullirá, pero no se saldrá del recipiente. Por otro lado, y dada la presión alcanzada no deben colocarse recipientes completamente cerrados en el interior, favoreciendo así que el vapor penetre. Las pipetas de vidrio serán taponadas con una pequeña cantidad de algodón por las partes superiores y envueltas, individualmente, en papel de platina. De igual manera, las puntas para las pipetas automáticas, placas de Petri de vidrio, matraces, Erlen Meyers serán envueltos con este papel.

74

Un medio de cultivo idóneo será aquel donde el material vegetal, ya sea, explantos, tejidos, células, pueda cultivarse y multiplicarse en óptimas condiciones

Todos los medios de cultivo se caracterizan por una serie de elementos comunes como son los macronutrientes, los micronutrientes y las vitaminas. A este conjunto se le denomina Medio Basal, pudiendo añadírsele una fuente de carbono (azúcares) o regulador de crecimiento. Los nutrientes son indispensables para el crecimiento de la planta. La adición de azúcares y hormonas coadyuvaría al mejor desarrollo de las mismas, satisfaciendo los requerimientos de carbono en un caso y, dirigiendo el patrón de crecimiento y desarrollo de los tejidos y las células en el otro.

En el caso particular de los vegetales marinos, el medio basal bien puede ser agua de mar, hablaríamos de la preparación de medios de “agua de mar enriquecida” tipo PES (Provasoli Enriched Seawater) o bien agua destilada a partir de la cual “construiríamos” un agua de mar, serían los llamados “medios artificiales”. En cualquiera de los casos, el agua es filtrada antes de añadir los componentes nutricionales. Esta filtración se realiza con filtros de diámetro de poro de 0.45 µm o inferior. Los filtros o membranas empleados tienen como base ésteres de celulosa o de policarbonato con una gran variedad de tamaños de poro. Así aunque es difícil eliminar los virus de las soluciones, algunas membranas se pueden emplear para separar las partículas víricas por combinación de varios tamaños de poro y porque estas quedan adsorbidas a las paredes del poro, durante su paso, debido a la carga eléctrica del filtro y de los microorganismos. Además dichas membranas tienen la ventaja de poder esterilizarse separadamente en autoclave y ser desechables.

75

Como modus operandi, el filtro se monta sobre un soporte a modo de embudo, generalmente de vidrio, que queda entre dos recipientes. Aplicando una presión negativa en el recipiente inferior o kitasato, la solución pasa a través de la membrana. Sistema de filtrado para esterilización de soluciones de sustancias termosensibles (hormonas, antibióticos, etc.)

Una vez disueltas las soluciones nutritivas, se procederá a ajustar el pH. Esta variable química es de gran importancia, ya que, valores de pH inferiores a 4 pueden afectar a la solubilidad y/o la absorción de alguno de los elementos integrantes del medio, así como, la actividad de las enzimas.

La preparación de las soluciones nutritivas se realiza generalmente agrupando aquellos componentes afines y que entre ellos, no produzcan fenómenos de precipitación. De esta manera, tendríamos distintas soluciones stock o madres conformadas por los macronutrientes, los micronutrientes, las vitaminas, y la solución de hierro con un agente quelante, respectivamente (Esquema 2). Las soluciones stock simplificarían la preparación del medio, así como, los errores de pesada con cantidades tan pequeñas.

En referencia a la solución de macronutrientes, existen 2 elementos indispensables: el nitrógeno y el fósforo. El nitrógeno se suele suministrar a partir de

76

una fuente inorgánica como el nitrato. Aunque las distintas recetas de los medios ya especifican la concentración a añadir, esta se suele situar entre los 1 y 20 mM. El fósforo, como parte de los ácidos nucleicos, puede añadirse en forma orgánica como sal sódica de glicerol-fosfato (50 µM) o inorgánica en concentraciones de (1-3 mM). Estos elementos se añaden directamente, tras ser pesados, al medio de cultivo.

Las soluciones de micronutrientes y vitaminas contienen un conjunto de sustancias que si bien, todas pueden no ser esenciales si contribuyen al bienestar del cultivo. Mención aparte requiere el hierro. Este elemento, importante para la síntesis de clorofila y otras reacciones de óxido-reducción, es insoluble a pH superiores a 7. Por consiguiente,

debe

suministrarse

con

un

agente

quelante

(EDTA,

ethylenediaminetetraacetic acid) para que esté disponible en el medio en un amplio rango de pH.

77

Protocolo de adición de sustancias nutritivas, fuentes de carbono, gelidificante y otras sustancias termolábiles

78

En las Tablas 4, 5 y 6 se indican los componentes de la solución de micronutrientes, vitaminas y EDTA-Fe necesarias para la preparación de un medio de agua de mar enriquecida (PES, Provasoli Enriched Seawater). Una vez preparadas, estas soluciones se almacenan en frascos de 50 mL a -20ºC excepto un pequeño volumen en uso, de cada una de ellas, que se mantiene en nevera por un tiempo no superior al mes.

Tabla 4. Composición de la solución de micronutrientes usada en la preparación del medio PES. Cantidad (mg) FeSO4 x 7 H2O

50.34

H3BO3

1140

MnSO4 x H2O

122.90

ZnCl2

10.48

CoCl2

4.03

Na-EDTA x 2H2O

1000

Agua destilada estéril 200 mL

79

Tabla 5. Composición de la solución de vitaminas usada en la preparación del medio PES.

Cantidad (mg) Tiamina-HCl

100

Biotina

1

Piridoxina

1

B12

0.2

Agua destilada estéril 100 mL

Tabla 6. Composición de la solución de EDTA-Fe usada en la preparación del medio PES. Cantidad (mg) FeSO4 x H2O

245

Na2-EDTA x 2 H2O

330

Agua destilada estéril 50 mL

En nuestro laboratorio, el medio comúnmente utilizado y que siempre ha revelado resultados adecuados es aquel basado en agua de mar enriquecida. Los componentes del medio PES se expresan en la Tabla 7. No obstante, la elección de un medio dependerá de los requerimientos nutritivos de las especies a cultivar, y de la respuesta que se desea obtener.

80

Tabla 7. Composición final del medio de cultivo de agua de mar enriquecida PES (Provasoli, 1968). NaNO3

70 mg

Na2-glicerol-fosfato

10 mg

Solución de micronutrientes 1mL Solución de vitaminas

1mL

Solución de EDTA-Fe

0.5 mL

Agua de mar estéril

1000 mL

pH 7.5-7.8 En ciertas ocasiones y principalmente con algas pardas, es posible añadir también carbón activo para retirar compuestos excretados de naturaleza fenólica, tóxicos para el crecimiento. La adición de este reactivo se hace tras un lavado preliminar en ácido entre el 0.5-3%. Sin embargo, hay que tener especial atención en ello. La adsorción de los compuestos fenólicos no se realiza de manera selectiva, retirándose inespecíficamente reguladores y otros compuestos añadidos al medio y no necesariamente perjudicial.

Los medios pueden prepararse en sólido o en líquido. El medio líquido se dispondrá en volúmenes determinados y recipientes apropiados para esterilizar según las normas mencionadas anteriormente. Los medios sólidos llevan un agente gelidificante, como agar, agarosa, gelrite, phytagel (Tabla 8), el cual se disolverá por calentamiento breve, una vez controlado el pH (Esquema 2). Ninguno de los agentes solidificantes son digeridos o adsorbidos por la planta, ni tampoco interactúan con los componentes del medio. Sin embargo, hay dos

81

características importantes a tener en cuenta: la primera es que a pH inferior a 5, el agente endurecedor puede no ejercer su papel, manteniéndose el medio líquido. La segunda, es que en función de determinados agentes como la gelrite o el phytagel, se necesita de una cantidad extra de cationes divalentes, tipo cloruro de calcio o sulfato de magnesio. La selección del tipo de agente gelidificante es bastante empírico. Hasta ahora la elección del mismo se basaba en el coste económico aunque ciertamente, algunos tejidos crecen mejor en un tipo de agente más que otro. En nuestro laboratorio, hemos probado el phytagel y el agar, siendo este último el más común. A continuación, exponemos algunas de las características más notables de estos compuestos. El agar, el agente solidificante más usado, se extrae de las algas rojas marinas, estando compuesto por agarosa y agaropectina. La agarosa contiene D- y L- galactosa, mientras que, la agaropectina contiene además ésteres de sulfato y ácido glucorónico. El agar se disuelve sobre los 100ºC y gelidifica sobre los 45º. A pesar de los distintos grados de agar comercializados, pueden existir en su composición determinadas trazas de fenoles, sales inorgánicas e incluso ácidos grasos de cadena larga. El agar no gelidifica a pH ácidos y la inclusión de carbón activo también puede inhibir esta polimerización. Las concentraciones de agar usadas en cultivo in vitro se sitúa entre 0.5-1% (p/v) La agarosa se extrae directamente del agar, dejando atrás los ésteres de sulfato. Al obtenerse tras un proceso extra de purificación, su coste se incrementa considerablemente y se usa solo en aquellos casos específicos como el cultivo de protoplastos. La gelrite es un polisacárido, que a diferencia del agar, se extrae de la bacteria Pseudomonas. La gelrite no contiene impurezas de naturaleza orgánica aunque si puede

82

contener las inorgánicas. Su gran ventaja es que da un medio solidificado claro con lo cual no sólo es fácil controlar la contaminación en los estadios iniciales de cultivo, sino que, es posible hacer un seguimiento fácil durante las etapas de enraizamiento. Por el contrario, uno de sus grandes hándicap es su preparación: 1) necesita una fuerte agitación para su disolución, no consiguiéndose siempre una homogeneización perfecta en el medio; 2) su solidificación es dependiente de la presencia de cationes divalentes (4-8 mM) y 3) está fuertemente vinculado al pH, con concentraciones estimadas de 0.64 o 0.50 g L-1 para valores de 7-8 de pH. El phytagel es similar a la gelrite pero de una mayor pureza. Contiene ácido glucorónico, ramosa y glucosa. Se usa en concentraciones entre 1.5-2 g L-1.

Tabla 8. Agentes gelidificantes más comunes. Entre paréntesis, las concentraciones óptimas usadas en nuestro laboratorio.

Concentración %, g en 100 mL Agar

0.5- 1 (0.8)

Agarosa

0.8-1

Gelrite

0.140

pH 6

0.064

pH 7

0.050

pH 8

0.040

pH 9

Phytagel 0.15-0.2 (0.1)

83

Los explantos cultivados in vitro son heterótrofos ya que viven a expensas de las fuentes de carbono suministradas

La presencia de azúcares, en el medio, mejora generalmente el crecimiento, ya que, bajo estas condiciones no siempre el material vegetal se comporta autotróficamente. La sacarosa es la más utilizada para propósitos de micropropagación en fanerógamas marinas, usándose en concentraciones de 1 -6% en el medio. En algas marinas, los monosacáridos como la galactosa y la glucosa son habituales, así como, el glicerol.

Hay que considerar que la presencia de azúcares en el medio puede desempeñar un papel como agente osmótico y que, la respuesta del material vegetal in vitro dependerá del mismo si no se tiene en cuenta la osmolaridad final del medio de cultivo. La osmolaridad (Osmol L-1) es el número de moléculas o iones presentes en una disolución por unidad de volumen, aunque también se puede expresar por unidad de peso (osmolalidad, Osmol Kg-1). Esta característica físico-química de los medios donde viven las células da idea de cuál es la presión osmótica que soporta las células y, previene los encogimientos o hinchamientos de las mismas. Los organismos marinos tienen una osmolaridad establecida en un rango de 1-1.1 Osmol L-1, y es la equivalente a un agua de 36-39 ‰ respectivamente de salinidad. En esta línea, la adición de una fuente de carbono supone la alteración de la concentración del agua de mar mediante las diluciones pertinentes con agua destilada. La ecuación 1 relaciona los parámetros de osmolalidad y salinidad del agua de mar, deducida del Handbook of Chemistry and Physics (1981) que nos servirá para ajustar la osmolaridad de nuestro medio de cultivo (Tabla 9).

84

osmolalidad (Osmol Kg-1) = 0.031 + 0.027 x (salinidad, ‰), r2= 0.9989 (1)

siendo la osmolalidad, la sumatoria de los moles de todos los componentes presentes en el agua de mar.

Tabla 9. Valores de osmolalidad (Osmol Kg-1) para un agua de mar de rango de salinidad 20-40 ‰. (Extraído del Handbook of Chemistry and Physics ,1981)

Salinidad Osmolalidad (‰)

(Osmol Kg-1)

20

0.578

25

0.724

30

0.869

35

1.009

40

1.145

La tabla 10 refleja la cantidad de Osmoles Kg-1 que aporta, la glucosa, la galactosa, la sacarosa, y el glicerol como fuentes de carbono más comunes en el cultivo de algas. Como se puede observar la adición de una fuente de carbono contribuye al incremento de la osmolalidad y por esta razón, el parámetro a modificar sería la salinidad.

85

Tabla 10. Valores de osmolalidad para las cuatro fuentes de carbono más comunes empleadas en cultivo de tejidos en un rango de concentración de 0.5-6%. (Extraído del Handbook of Chemistry and Physics, 1981)

Concentración

Osmolalidad (Osmol Kg-1)

% (g en 100 mL) Glucosa/Galactosa Sacarosa monohidratada

Glicerol

pm 342.30 pm 92.09

pm 198.17

0.5

0.025

0.015

0.039

1

0.057

0.030

0.097

2

0.115

0.060

0.221

3

0.174

0.091

0.337

4

0.233

0.123

0.456

5

0.295

0.156

0.580

6

0.359

0.190

0.708

Veamos un ejemplo de cálculo: Queremos preparar un medio de cultivo basado en agua de mar (36 ‰) enriquecida, suplementado con glicerol al 2%. Si sustituimos en la ecuación 1 el valor de la salinidad, tendremos que esa agua de mar tiene una osmolalidad de 1.003 Osmol Kg-1. La adición de 2% glicerol, según la tabla 10, incrementa este valor a 1.224 Osmol Kg-1. Para ajustar al valor teórico de 1 Osmol Kg-1 correspondiente a

los organismos

marinos, tenemos en cuenta que la osmolaridad es el resultado de la sumatoria de todos los componentes presentes. Luego: Osmoles Kg-1 totales deseados = osmoles agua mar + osmoles glicerol

86

y por tanto: 1= x+ 0.224 resultando en una osmolalidad para el agua de mar de 0.776 ≅ 0.8, y debiendo diluir el agua de mar un 80%, es decir 80 mL de agua mar +20 mL de agua destilada.

Los reguladores de crecimiento tienen la capacidad de afectar a los procesos fisiológicos en concentraciones muy bajas

Las necesidades de reguladores de crecimiento varían con los tipos de tejidos y los niveles endógenos de estos reguladores, así como con la finalidad del cultivo in vitro (regeneración, formación callo, enraizamiento) (Tabla 11). No obstante, el tipo de regulador, su concentración o el efecto combinado de alguno de ellos debe ser optimizado para cada especie de alga, teniendo en cuenta que, en estos vegetales, las hormonas no ejercen el control exclusivo sobre un determinado proceso fisiológico, y que las concentraciones de estas sustancias no deben exceder del orden de 10-5 M ya que podrían actuar como fuente de carbono o de nitrógeno. Se reconocen ocho grandes grupos de reguladores de crecimiento. De ellos los cinco grupos considerados como grupos clásicos de hormonas son las auxinas, las citoquininas, las giberelinas, el ácido abscícico y el etileno. Las poliaminas, los brasinoesteroides y los jasmonatos son de reciente acepción como tales por su papel durante todas las etapas del ciclo biológico de las plantas. Las auxinas son los primeros reguladores descubiertos en las plantas. La principal auxina es el

ácido indol 3 acético,

IAA, y su

descubrimiento hizo que se investigaran y

87

obtuvieran

auxinas

sintéticas

de

actividad

similar

como

el

2,4-D

(2,4-

Diclorofenoxiacético). Las citoquininas son derivados de la purina, que presentan una cadena lateral de 5 carbonos. La citoquinina natural más extendida en plantas es la zeatina, mientras que, la sintética es la kinetina. Las giberelinas son compuestos orgánicos naturales. Se les designa con una A para determinar que son naturales y un número según el orden del descubrimiento. La más importante es la GA3, conocida como ácido giberélico. El etileno y el ácido abscícico están implicados en las etapas finales de desarrollo o de respuestas al estrés, pero mientras, el etileno se sintetiza a partir de la metionina, el abscícico lo hace a partir de los carotenoides. Las poliaminas derivan de la ornitina y de la arginina y se caracterizan porque son compuestos que poseen dos o más grupos amino (-NH2). Independientemente de su designio, no hay que olvidar que estos componentes son termolábiles y consecuentemente, su esterilización debe realizarse por filtración (Esquema 2) y añadirse al medio líquido una vez frío, o al sólido cuando su temperatura haya descendido hasta los 40º C y todavía no ha adquirido la solidez, rotando el recipiente para homogeneizar la mezcla. Para estos casos, existen unidades de filtración para volúmenes pequeños de entre 1-10 mL y donde el líquido es impulsado a través de la membrana por acción del una jeringa.

88

Tabla 11. Reguladores de crecimiento y principales funciones.

GRUPO AUXINAS

COMPUESTOS PRINCIPALES IAA, IBA, 2,4-D

FUNCIONES

• • • •

CITOQUININAS

BAP Zeatina Kin

• • • •

ÁCIDO GIBERÉLICO

GA3

ÁCIDO ABSCÍCICO

ABA

• •

• • •

ETILENO

POLIAMINAS

Estimulan la división celular y crecimiento. Inhiben desarrollo de raíces laterales. Promueven la organogénesis en callos celulares Retrasan la sensecencia Incrementa La tasa de división celular estimulan la brotación de yemas y germinación de semillas Promueve la latencia en yemas Inhibe la división celular Inhibe el crecimiento.

•

Respuestas diversas: promueve la maduración y la senescencia. geotropismo de las raíces

•

Promueve la divisón celular.

•

Put, Spd, Spm

Crecimiento y diferenciación celular. Elongación celular Crecimiento y maduración frutos Geotropismo positivo

Una vez añadidos todos los componentes al medio, este será vertido en los tubos, o placas o recipientes hasta su enfriamiento total. En este momento, hay que trabajar con cierta diligencia lo más cerca del mechero encendido, manteniendo la boca del recipiente de cultivo y las placas o tubos cerca de la llama. Este reparto debe hacerse cuando el medio está los suficientemente frío como para no quemarnos pero considerando que si el medio contuviera un gelidificante hay que habilitarlo en las

89

placas antes de que se solidifique. El reparto no puede hacerse en caliente porque se produciría una alta condensación en la tapa de las placas de cultivo. Todas las placas deben taparse y una vez frías se cierran con cinta parafina hasta su uso.

A continuación, los explantos se dispondrán de uno en uno en el caso de los tubos, mientras que, como aproximación, pueden sembrarse hasta 4 fragmentos en placas de Petri de 6 cm o 1 por tubo. Realizada la siembra, se mantendrán en una cámara de cultivo bajo condiciones de temperatura, iluminación y fotoperiodo controladas.

En el cultivo "in vitro", además de las condiciones de esterilidad en las que se llevan a cabo, es fundamental el control de los factores físicos: temperatura y luz (intensidad y fotoperiodo)

Inevitablemente, la temperatura de la cámara de cultivo estará influenciada por las fuentes de luz dispuestas en su interior, así como, la temperatura ambiente exterior. Es por ello conveniente conocer la variación de la temperatura en las diferentes zonas de la cámara y si se cree necesario hacer circular aire dentro de la cámara mediante un sistema de ventilación. Respecto a la luz, sabemos que como radiación electromagnética, su espectro está compuesto por diferentes longitudes de onda. El ojo humano, por ejemplo, percibe solo aquellas entre los 400 y 800 nm y los aparatos que miden dentro de este rango revelan la medida de la radiación activa fotosintética o PAR (Photosynthetic Active Radiation). Esta cantidad de luz que incide sobre el material vegetal se expresa en función de un área en un tiempo determinado en µmoles de fotones m-2 s-1. No existe una norma

90

establecida para calcular la cantidad de irradiación. Nuestra experiencia nos indica que un rango entre 25-50 µmoles fotones m-2 s-1 es adecuada para el cultivo y como aproximación, suele situarse entre un 5- 10%

de aquella captada con la máxima

actividad solar. Las necesidades de luz en cultivo siempre son inferiores a aquellas condiciones in vivo, puesto que, se comportan solo parcialmente de manera autotrófica y además se produciría un fuerte aumento de la temperatura por efecto del recipiente de cultivo.

De cualquier manera, tampoco hay que olvidar que la mayoría de los procesos fisiológicos, como la esporulación o la floración en plantas superiores, están regidos por radiaciones concretas. Por consiguiente, la iluminación de la cámara debe reproducir el conjunto de radiaciones antes aludido. En este sentido, las lámparas o bombillas fluorescentes de tipo luz día reproducen un espectro relativamente fiel a las condiciones naturales.

Otro factor a considerar aparte de la cantidad y espectro, es el número de horas de luz a las que está sometido el material vegetal: el fotoperiodo. Como norma unas 16 h de luz son apropiadas para la sustentación del crecimiento y desarrollo de las macroalgas marinas. Sin embargo, para determinados procesos como la inducción de las tetraesporas, ha sido necesario acortar las horas de luz. En el mercado existen programadores, tanto analógicos como digitales, que permiten regular las horas de luz, mediante una simple conexión a la corriente eléctrica.

91

El tipo de crecimiento y el número de individuos están afectados por la procedencia de explanto que se siembre o por las características del medio de cultivo

Durante la fase de crecimiento y multiplicación, los explantos sembrados se deben sub-cultivar cada cierto tiempo a un nuevo medio ya bien en una re-siembra o fragmentándolos en trozos más pequeños. Estas labores hay que realizarlas dentro de la cámara de flujo laminar, bajo las mismas condiciones de limpieza, desinfección y esterilización ya comentadas. No se puede olvidar que algunos contaminantes permanecen en estado de latencia, manifestándose cuando encuentran condiciones idóneas de nutrientes o físico- químicas como la temperatura. Recordemos que son aquellos inherentes al material vegetal (endófitos), los asociados

externamente al

material o aquellos propios del manejo inadecuado en el laboratorio. Otro de los procesos negativos, relacionados con la siembra y que conlleva una baja supervivencia de los individuos, se achaca a la vitrificación de los explantos. En medios sólidos, los explantos deben de estar embebidos en el medio cuidando que no estén ni enterrados para que la incidencia de la luz sea correcta, ni en la superficie para evitar lo que se conoce como vitrificación. La vitrificación genera individuos con una morfología alterada de aspecto vidrioso.

El número de plantas que se obtengan del cultivo dependerá del numero de repicados, de las condiciones de los medios y del tipo de explanto. En macroalgas marinas, los factores que influyen en la elección del explanto son la edad y el estado fisiológico del individuo, el tamaño y el estado “sanitario” de la planta madre o individuo donante. En las plantas superiores, como las fanerógamas marinas, también afectaría el tipo de órgano que sirve como fuente de explantos o la estación del año en la

92

que se recolecta. Como también indicábamos, el cultivo de individuos aclimatados en acuarios y libres de contaminantes favorecerá la obtención de explantos en buen estado, de igual manera que sus progenitores, por lo que se recomienda mantener las plantas donantes creciendo bajo condiciones de intensidad de luz y temperatura de la cámara de cultivo.

Considerando la estructura de Eucheuma, se puede caracterizar dos tipos de explantos de forma precisa: 1. Explanto distal que se corresponde con fragmentos de la zona terminal del talo. Puede poseer ramificaciones pequeñas en el ápice. En el fragmento, en sí mismo, puede distinguirse la zona distal o parte del ápice y la zona proximal o zona de corte. (Fig 1) 2. Explanto medio perteneciente a la zona central. Dada su ubicación es de forma cilíndrica y normalmente no tiene ramificaciones (Fig 2)

Dos tipos de fragmentos de Eucheuma. (1) Explanto distal. La flecha indica la zona de corte o proximal. (2) Explanto cilíndrico o medio. De nuevo, las flechas indican las zonas de corte. En ambos casos, escala= 0,2 cm.

93

Los nuevos individuos se generarán bien por multiplicación vegetativa, generando talos, o bien mediante la formación de callo y posteriormente la formación de nuevos talos (Esquema 1). La multiplicación vegetativa dará lugar a nuevos brotes (Fig 3), mientras que, el callo se fundamentará en un crecimiento desorganizado o indiferenciado que dará lugar a masas celulares con crecimiento activo y generalmente asociadas a las zonas de corte (Fig 4). Si bien esta última implica un cierto riesgo de variación somaclonal, el número de explantos es mayor debido a la capacidad de estos callos de disgregarse manteniendo, por muy pequeños que sean esos fragmentos, la capacidad de crecer y dividirse cada uno de estos. La multiplicación vegetativa, por el contrario, estará limitada por el tamaño de los explantos y los repicados que de él se obtengan. Esta etapa es muy crítica, ya que, los explantos en cultivo están sometidos a estrés derivado del propio daño que se le infringe durante su separación de la planta madre o tras las continuas divisiones. En esta situación, el tejido podrá liberar sustancias de procedencia fenólica o quinonas, fácilmente oxidables, e inhibirá el crecimiento de los fragmentos. Como contrapunto, durante el establecimiento del cultivo o las sucesivas etapas de multiplicación de los fragmentos, se debería considerar la aclimatación durante un periodo de tiempo de 2-3 días en condiciones de oscuridad, adicionar antioxidantes como el ácido ascórbico, o bien como hemos indicado añadir agentes adsorbentes de fenoles como el carbón activo.

94

Fragmentos de Eucheuma con distintos tipos de desarrollo. (3) Regeneración. (4) Formación de callo en la zona de corte. En ambos casos, escala = 0,14 cm

De cualesquiera de las maneras, ambas formas de crecimiento (multiplicación o callo) están directamente afectadas por los reguladores de crecimiento y consecuentemente la optimización de los protocolos de cultivo deben atenerse a las ratios y/o concentraciones entre las auxinas, citoquininas, poliaminas en el medio. Como norma, la acción de un regulador puede estar afectado por la presencia de otras de manera sinergística o antagónica, haciéndose necesaria los correspondientes ensayos de prueba.

Una micropropagación exitosa culmina con un estudio histológico del material propagado

El estudio histológico podrá determinar en qué lugar del explanto ocurren los cambios morfogénicos, así como, la disposición y tipo celular

implicados en el

desarrollo. La experiencia nos ha demostrado que con las técnicas histológicas e histoquímicas se aportan datos estables y consistentes sobre las características del material a examen a la vez que permite la confirmación y evaluación correcta de lo que estamos viendo.

En las figuras 5 y 6 se muestran cortes longitudinales de un 95

crecimiento organizado o regeneración y otro desorganizado correspondiente a un callo. Sin entrar en un exhaustivo detalle de estas técnicas, decir que el método básico para la preparación y examen de los explantos consiste de una fijación química, una deshidratación, infiltración e inclusión en resina. El objetivo de la fijación química es preservar la estructura de las células con las mínimas alteraciones en relación al estado de los explantos vivos. La calidad de este proceso resulta de la elección del fijador y del vehículo o tampón que se utilice. Los fijadores más comunes son el glutaraldehído y el formaldehído, usados individual o conjuntamente. Por el contrario, existen en el mercado un gran abanico de posibles tampones. Su eficacia y, por consiguiente, la elección de alguno de ellos dependerá de la capacidad de mantener el pH, de su composición específica y del control de la osmolaridad. En la deshidratación se prepara al material para ser embebido en una resina. Por ello como la mayoría de estas resinas son inmiscibles en agua, los especimenes pasan a través de una secuencia de soluciones de concentración creciente de agente deshidratante, de naturaleza orgánica, como el etanol o la acetona. El gran problema es que durante el periodo de intercambio del agua de los intersticios del tejido por el agente orgánico, también se extraen compuestos solubles en ellos como los lípidos. En este sentido, la elección de un medio de inclusión dependerá de nuestras necesidades específicas. Para microscopía óptica, el caso que nos ocupa, existen resinas solubles (Historesin MR) en agua que minimizan este problema.

96

Secciones semifinas (5µm) de Eucheuma. (5) Se corresponde con un corte longitudinal de un callo. La flecha indica la zona de crecimiento desorganizado. (6) Sección longitudinal de una zona regenerada. En ambos casos, escala = 400 µm. Tinción Azul de Toluidina.

97

REFERENCIAS 98BIBLIOGRÁFICAS Y TABLAS

AGUIRRE-LIPPERHEIDE, M. & EVANS, L.V. (1993). Sterilization protocol for the Dictyotales (Phaeophyceae). J. Phycol., 29: 243 – 251. AGUIRRE-LIPPERHEIDE, M. ESTRADO-RODRIGUEZ, F.J. & EVANS, L.V. (1995). Facts, Problems and need in seaweed tissue culture - An Appraisal. J. Phycol., 31: 677 - 688. AMANO, H. & NODA, H. (1994). Effects of plant growth regulators, organic acids and sugars on chemical constituents in the tissue culture of Ulva pertusa. Fish. Sci., 60 (4): 449-454. ANDERSON, N.J. BLOMQVIST, P. & RENBERG, I. (1997). An experimental and palaeoecological study of algal responses to lake acidification and liming in three central Swedish lakes. Eur. J. Phycol., 32: 35-48. ARAKI, T. HAYAKAWA, M. TAMARU, Y. YOSHIMATSU, K. & MORISHITA, T. (1994). Isolation and regeneration of haploid protoplasts from Bangia atropurpurpea (Rhodophyta) with marine bacterial enzymes. J. Phycol. 30: 1040 – 1046. ARAKI, T. LU, Z. & MORISHITA, T. (1998). Optimization of parameters for isolation of protoplasts from Gracilaria verrucosa (Rhodophyta). J. Mar. Biotechnol., 6(3):193197. ASENSI, A. GALL, E. MARIE, D. BILLOT, C. DION, P. & KLOAREG, B. (2001). Clonal propagation of Laminaria digitata (Phaeophyceae) sporophytes through a diploid cell – filament suspension. J. Phycol., 37: 411 – 417. AUGIER, H. (1976). Les hormones des algues: état actuel des connaisance. II. Recherches et tentatives d'identification de gibbérellines, des cytokinines, et de diverses autres substances de nature hormonales. Bot. Mar., 19: 245-254. AURISIANO, N. BERTANI, A. MATTANA, M. & REGGIANI, R. (1993). Abscisic acid induced stress-like polyamines pattern in wheat seedlings and its reversal by potassium ions. Physiol. Pl., 89: 687-692. BADINI, L. PISTOCCHI, R. & BAGNI, N. (1994). Polyamine transport in the seaweed Ulva rigida (Cholorophyta). J. Phycol., 30: 599 – 605. BEER, S. & BJORK, M. (1994). Photosynthetic properties of protoplasts as compared with thalli of Ulva lactuca (Chlorophyta). J. Phycol., 30: 633 – 637.

99

BERGES, J.A. FRANKLIN, D.J. & HARRISON, P.J. (2001). Evolution of an artificial seawater medium: improvements in ESAW over the last two decades. J. Phycol., 37: 1138-1145. BJÖRK, M. EKMAN, P. WALLIN, A. & PEDERSEN, M. (1990). Effects on growth rate and other factors of protoplast yield from four species of Gracilaria (Rhodophyta). Bot. Mar., 33: 433 - 439. BJORK, M. GOMEZ-PINCHETTI, J. J. GARCIA – REINA, G. & PEDERSEN, M. (1992). Protoplast isolation from Ulva rigida (Chlorophyta). Br. Phycol. J., 27: 401 – 407. BRACHET, J. MANNOT, P. BOLOUKHERE, M. BALTUS, E. & HANOCQQUERTIER, J. (1978). Effects d’un in hibiteur de la synthése des polyamines sur la morphogenese chez l’Oursin, la Chétoptére et l’algue. Acetabularia. Comp. Rend. Acad. Sci., 387: 1289 - 1292. BRADLEY, P. M. (1991). Plant hormones do have a role in controlling growth and development of algae. J. Phycol., 27: 317 – 321. BRADLEY, P.M. CHENEY, D.P. & SAGA, N. (1988). One step antibiotic disk method for obtaining axenic cultures of multicellular marine algae. Pl. cell tis. org. cult., 12: 55 – 60. BRADLEY, P.M. & CHENEY, D.P. (1986). Morphogenetic variation in tissue cultures of the red seaweed Agardhiella subulata. Amer. J. Bot., 73: 649. BRADLEY, P.M. & CHENEY, D.P. (1990). Some effects of plant growth regulators on tissue cultures of the marine red alga Agardhiella subulata (Gigartinales, Rhodophyta). Hydrobiologia, 204/205: 353 - 360. BROWN, D.C. LEUNG, D.W. & THORPE, T.A. (1979). Osmotic requirements for shoot formation in tobacco callus. Physiol. Plant., 46: 36 – 41. BUTLER, D.M. & EVANS, L.V. (1990). Cell and tissue culture of macroalgae. In Introduction to applied phycology (Akatsuka I, editor), 629-645. SPB Academic Publishing bv, The Hague, The Netherlands. BUTLER, D.M. OSTGAARD, A. BOYEN, C. EVANS, L.V. JENSEN, A. & KLOAREG, B. (1989). Isolation conditions for high yields of protoplasts from Laminaria saccharina and L. digitata. J. Exp. Bot., 40: 1236 - 1237.

100

BUTLER, A. SOEDJAK, H.S. POLNE-FULLER, M. GIBOR, A. BOYEN, C. & KLOAREG, B. (1990). Studies of vanadium-bromoperoxidases using surface and cortical protoplasts of Macrocystis pyrifera (Phaeophyta). J. Phycol., 26: 589 - 592.

CHEN, L.C.M. (1982). Callus like formation from Irish moss. Biol. Bull. Nat. Taiwan Normal Univ., 17: 63 – 67. CHEN, L.C.M. (1986). Cell development of Porphyra miniata (Rhodophyceae) under axenic culture. Bot. Mar. 29: 435 - 440. CHEN, L.C.M. (1987). Protoplast morphogenesis of Porphyra leucosticta in culture. Bot. Mar., 30: 399 – 403. CHEN, L.C.M. (1989). Cell suspension cultures from Porphyra linearis (Rhodophyta) a multicellular marine alga. J. Appl. Phycol., 1: 153-159. CHEN, L.C.M. & TAYLOR, A.R.A. (1978). Medullary tissue culture of the red alga Chondrus crispus. Can. J. Bot., 56: 883 - 886. CHEN, L.C.M. CRAIGIE, J.S. & XIE, Z.K. (1994). Protoplast production from Porphyra linearis using a simplified agarase procedure capable of commercial application. J. Appl. Phycol., 6: 35-39. CHEN, L.C.M., MCCRACKEN, I. R. & XIE, Z. K. (1995). Electrofusion of protoplasts of two species of Porphyra (Rhodophyta). Bot. Mar., 38: 335 – 338. CHEN, Y-B. ZEHR, J.P. & MELLON, M. (1996). Growth and Nitrogen fixation of the diazotrophic filamentous nonheterocystous cyanobacterium Trichodesmium sp. IMS 101 in defined media: evidence for a circadian rhythm. J. Phycol., 32: 916 – 923. CHEN, Y.C. (1998). Development of protoplasts from holdfasts and vegetative thalli of Monostroma latissimum (Chlorophyta, Monostromaceae) for algal seed stock. J. Phycol., 34: 1075 – 1081. CHEN, Y.C. & CHIANG, Y.M. (1994). Development of protoplasts from Grateloupia sparsa and G. filicina (Halymeniaceae, Rhodophyta). Bot. Mar., 37: 361-366. CHEN, Y.C. & SHIH, H.C. (2000). Development of protoplasts of Ulva fasciata (Chlorophyta) for algal seed stock. J. Phycol., 36: 608 - 615.

101

CHENEY, D. P. (1986). Genetic engineering in seaweeds: application and current status. Nowa Hed., 81: 22 - 29. CHENEY, D.P. METZ, B. & STILLER, J. (2001). Agrobacterium-mediated genetic transformation in the macroscopic marine red alga Porphyra yezoensis. J. Phycol., 37(3): 11. CHENEY, D.P. MAR, E. SAGA, N. & VAN DER MEER, J. (1986). Protoplast isolation and cell division in the agar producing seaweed Gracilaria (Rhodophyta). J. Phycol., 22: 238-243. CHENG, F. (1996). High cell density culture of microalgae in heterotrophic growth. Trends Biotechnol., 14: 421 - 426. CHENG, F. & JOHNS, M.R. (1995). A strategy for high cell density culture of microalgae with inhibitory substrates. J. Appl. Phycol., 7: 43 - 46. CHENG, J.Y. & ANTIA, N.A. (1970). Enhancement by glycerol of phototrophic growth of marine planktonic algae and its significance to the ecology of glycerol pollution. J. Fish. Res. Board Canada., 27: 335 – 346. CHIANG, Y.-M. (1993). The developmental sequence of the marine red alga Grateloupia filicina in culture. Kor. J. Phycol. 8(2): 231 – 237. COURY, D.A. NAGANUMA, T. POLNE-FULLER, M. & GIBOR, A. (1993). Protoplasts of Gelidium robustum (Rhodophyta). Hydrobiologia, 260-261(1): 421 – 427. DAS, S. BOSE, A. & GHOSH, B. (1995). Effect of salt stress on polyamine metabolism in Brassica compestris. Phytochem., 39(2): 283 - 285. DAWES, C.J. (1971). Indole-3-acetic acid in the green algal coenocyte Caulerpa prolifera (Chlorophyceae, Siphonales). Phycologia, 10: 375-379. DAWES, C. J. & KOCH, E. W. (1991). Branch, micropropagules and tissue culture of the red alage Eucheuma denticulatum and Kappaphycus alvarezii farmed in the Philippines. J. Appl. Phycol., 3: 247 – 257. DEBERGH, P. (1983). Effects of agar brand and concentration on the tissue culture medium. Physiol. Plant., 59: 270 - 276. 102

DEBERGH, P. HARBAOUI, Y. & LENNEUR, R. (1981). Mass propagation of globe artiochoke (Cynara scolymus): evaluation of different hypotheses to overcome vitrification with special reference to water potential. Physiol. Plant., 53: 181-187. DEL DUCA, S. DONDINI, L. DELLA MEA, M. MUÑOZ DE RUEDA, P. & SERAFFINI-FRACASSINI, D. (2000). Factors affecting transglutaminase activity catalysing polyamine conjugation to endogenous substrates in the entire chloroplast. Pl. Physiol. Biochem., 38(6): 429 - 439. DRUEHL, L.D. & HSIAO, S.I.C. (1969). Axenic culture of Laminariales in defined media. Phycologia, 8: 47 – 49. DRUELH, L & BOALCH, R. (1981). Manipulation of the Laminaria life – cycle and its consequences for kombu mariculture. Proc. Int. Seaweed Symp., 10: 575 – 580. DUCREUX, G. & KLOAREG, B. (1988). Plant regeneration from protoplasts opf Sphacelaria pyrifera (Phaeophyta). J. Phycol., 26: 384 – 387. DWORETZKY, B. KLEIN, R.M. & COOK, P.W. (1980). Effect of growth substances on apical dominance in Sphacelaria furcigera (Phaeophyta). J. Phycol., 16: 239-242. ENOMOTO, S. & HIROSE, H. (1972). Culture studies on artifically induced aplanospores and their development in the marine alga Boergesenia forbesii (Harvey) Feldmann (Chlorophyceae, Siphonocladales). Phycologia, 11: 119 - 122. EVANS, P.T. & MALMBERG, R.L. (1989). Do polyamines have roles in plant development? Ann Rev Pl. Mol. Biol., 40: 235 - 269. EVANS, L.V. & TREWAVAS, A. (1991). Is algal development controlled by plant growth substances? J. Phycol., 27: 322-326.

FANG, T.C. YAN, Z.M. & WANG, Z.C. (1983). Some preliminary observation on tissue culture in Laminaria japonica and Undaria pinnatifida. Kexue Tongbao. Sci. Sini. 28: 247 – 249. FISHER, D.D. & GIBOR, A. (1987). Production of protoplasts from the brown alga, Sargassum muticum (Yendo) Fensholt (Phaeophyta). Phycologia, 26 (4): 488 - 495.

103

FLORES, H.E. (1990). Polyamines and plant stress. In Stress responses in plants: adaptation and acclimatation mechanism (Flores, H. E. editor), 217-239. Whiley-Liss Inc. New York. FRIES, L. (1959). Goniotrichum elegans: a marine red alga requiring vitamin B12. Nature, 183: 558 - 559. FRIES, L. (1961). Vitamin requirements of Nemalion multifidum. Experientia, 17: 75. FRIES L. (1963). On the cultivation of axenic red alga. Physiol. Pl., 16: 695 - 708. FRIES, L. (1964). Polysiphonia urceolata in axenic culture. Nature, 202:110. FRIES, L. (1973). Requirements for organic substances in seaweeds. Bot. Mar., 16:1931. FRIES, L. (1974). Growth stimulus of axenic red algae by simple phenolic compounds. J. exp. Mar. Biol. Ecol., 15: 1 - 9. FRIES, L. (1975). Some observations on the morphology of Enteromorpha linza (L.) J. Ag. and Enteromorpha compressa (L.) Grev. Bot. Mar., 18: 251 - 253. FRIES, L. (1977). Growth regulating effects of phenylacetic acid and phydroxyphenilacetic acid on Fucus spiralis in axenic culture. Phycologia, 16: 451-455. FRIES, L. (1980). Axenic tissue cultures from the sporophytes of Laminaria digitata and Laminaria hyperborean. J. Phycol., 16: 475 - 477. FRIES, L. (1984). Induction of plantlets in axenically cultivated rhizoids of Fucus spiralis. Can. J. Bot., 62: 1616 – 1620. FRIES, L. (1985). Propagation of Fucus (Fucales, Phaeophyta) by hairs with trichothallic growth. Phycologia, 24: 481 - 494. FRIES, L. (1988). Ascophyllum nodosum (Phaeophyceae) in axenic culture and its response to the endophytic fungus Mycosphaerella ascophylli and epiphytic bacteria. J. Phycol., 24: 333 – 337. FRIES, L. & IWASAKI, H. (1963). On the cultivation of axenic red algae. Physiol. Pl., 16: 695 – 708.

104

FRIES, L. & IWASAKI, H. (1976). P - hydroxyphenylacetic acid and other phenolic compounds as growth stimulators of the red alga Porphyra tenera. Pl. Sci. Lett., 6: 299 – 307. FUJITA, Y. & MIGITA, S. (1985). Isolation and culture of protoplasts from some seaweeds. Bull. Fac. Fish. Nagasaki Univ., 57: 39 – 45. FUJITA, Y. & SAITO, M. (1990). Protoplast isolation and fusion in Porphyra. Hydrobiologia, 204/205: 161-166. FUJIMURA, T. & KAJIWARA, T. (1990). Production of bioflavor by regeneration from protoplasts of Ulva pertusa (Ulvales, Chlorophyta). Hydrobiologia, 204/205: 143 149. FUJIMARA, T. KAWAI, T. SHIGA, M. KAJIWARA, T. & HATANAKA, A. (1989). Regeneration of protoplasts into complete thalli in the marine alga Ulva pertusa. Nippon Suisan Gakkaishi, 55(8): 1353-1359. GABRIEL, M. (1970). Formation, growth and regeneration of protoplasts of the green alga, Uronima gigas. Protoplasma, 70: 135 – 138. GALL, Y. BRAUD, J.P. & KLOAREG, B. (1990). Protoplast production in Chondrus crispus gametophytes (Gigartinales, Rhodophyta). Pl. Cell. Reports, 8: 582 - 585. GALL, E., CHIANG, Y. M. & KLOAREG, B. (1993). Isolation and regeneration of protoplasts from Porphyra dentata and Porphyra crispata. Eur. J. Phycol., 28:277 – 283 GALSTON, A.W, KAUR-SAWHNEY, R. ALTABELLA, T. & TIBURCIO, A. F. (1997). Plant polyamines in reproductive activity and response to abiotic stress. Bot. Acta., 110: 198 -207. GAMBORG, O.L. (2002). Plant Tissue Culture. Biotechnology. Milestones. In vitro Cell. Dev. Biol. Plant., 38: 84-92. GARCÍA-JIMÉNEZ, P. RODRIGO, M. & ROBAINA, R.R. (1998). Influence of plant growth regulators, polyamines and glycerol interaction on growth and morphogenesis of carposporelings of Grateloupia cultured in vitro. J. Appl. Phycol., 10: 95 – 100. GARCÍA-JIMÉNEZ, P. ROBAINA, R. R. LUQUE, A. & TSEKOS, I. (1996). Glycerol-activated cellular division and biosynthetic activity during growth and 105

morphogenesis of carpospore seedling of Grateloupia doryphora (Cryptonemiales, Rhodophyta). Phycologia, 35(3): 261-269. GARCÍA- JIMÉNEZ, P. MARIÁN, F. D. RODRIGO, M. & ROBAINA, R. R. (1999). Sporulation and sterilization method for axenic culture of Gelidium canariensis. J. Biotech., 70: 227 – 229.

GIBOR, A. & IZAWA, M. (1963). The DNA content of the chloroplasts of Acetabularia. Proc. Nat. Acad. Sci., 50: 1164 – 1169. GIBOR, A. POLNE, M. BINIAMINOV, M. & NEUSHUL, M. (1981). Exploratory studies of vegetative propagation of marine algae: procedure for obtaining axenic tissues. In Proceedings of X ISS Goteberg, Sweden (Levring, T., editor), 587 – 593. Walter de Gruyter, Berlin, New York. GOLDMAN, J.C. & MC CARTHY, J.J. (1978). Steady state growth and ammonium uptake of a fast growing marine diatom. Limnol. Oceanogr. 23: 695 - 703. GROSS, W. (1990). Preparation of protoplasts from the carrageenophyte Gigartina corymbifera (Kutz) J. Ag. (Rhodophyta). J. Microb. Methods, 12: 217 - 223. GROSSMAN, A.R. (2005). Paths towards algal genomics. Pl. Physiol., 137: 410 - 427. GUILLARD, R.R.L. (1975). Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. In Culture of Marine Invertebrate Animals (Smith, W.L. Chanle, M. H. editors), 26-60. Plenum Press, New York, USA. GUILLARD, R.R.L. & HARGRAVES, P.E. (1993). Stichochrysis immobilis is a diatom, not a chyrsophyte. Phycologia, 32: 234 – 236. GUILLARD, R.R.L., & RYTHER, J.H. (1962). Studies on marine planktonic diatoms. I Cyclotella nana and Detonula confervacea. Can. J. Microbiol., 8: 229 - 239. GUSEV, M. V. TAMBIEV, A. H. KIRIKOVA, N. N. SHELYASTINA, N. N & ASLANYAAN, R. R. (1987). Callus formation in seven species of agarophyte marine algae. Mar. Biol., 95: 593 - 597.

106

GUZMÁN-URIÓSTEGUI, A. GARCÍA-JIMÉNEZ, P. MARIÁN, F. ROBLEDO, D. & ROBAINA, R.R. (2002). Polyamines influence maturation in reproductive structures of Gracilaria cornea (Gracilariales, Rhodophyta). J. Phycol., 38: 1169 - 1175. HARRISON, P.J. & BERGES, J.A. (2004). Marine culture media. In: Essentials of medical geology, 21-33. Academic Press. HARRISON, P.J. WATERS, R.E. & TAYLOR, F.J.R. (1980). Abroad spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton. J. Phycol., 16: 28 - 35. HEMALATHA, R. & RENGASAMY, R. (1999). Effect of plant growth regulators on Gracilaria edulis (Gmelin). Seaweed Res. Util., 21(1-2): 85-89. HOBBIE, J.E. & BENNETT, M.E. (1972). The uptake of glucose by Chlamydomonas sp. J. Phycol., 8: 392 - 398. HURTADO, A.Q. & CHENEY, D.P. (2003). Propagule production of Eucheuma denticulatum (Burman) Collins et Harvey by tissue culture. Bot. Mar., 46: 338 – 341. IVANOVA, A.P. ROBAINA, R.R. MARTIN, J. & STEFANOV, K.L. (1999). Effect of glycerol on the lipids in the red alga Grateloupia doryphora. Grasas y Aceites, 50(6): 469 - 471. IWASAKI, H. (1965). Nutritional studies of the edible seaweed Porphyra tenera. I. The influence of different B12 plant hormones purines and pyrimidines on the conchocelis. Pl. Cell Physiol., 6: 325-337. JENNINGS, R.C. (1969). Cytokinins as endogenous growth regulators in the algae Ecklonia and Hypnea. Austr. J. Biol. Sci., 22: 621-627. JENNINGS, R.C. (1971). Studies on the regulation of algal gibberellin. Austr. J. Biol. Sci., 24: 115 - 124. JOSEPH, I. & CHENNUBHOTLA, V.S.K. (1999). Gibberellic acid and 2,4-D as growth regulators in laboratory culture of seaweeds. Indian J. Mar Sci., 28 (1): 66-69. KACZYNA, F. & MEGNET, R. (1993). The effect of glycerol and plant growth regulators on Gracilaria verrucosa (Gigartinales, Rhodophyceae). Hydrobiologia, 268: 57 – 64.

107

KAJIWARA, T. HATANAKA, A. TAICHIRO, F. KAWAI, T.& IRIE, M. (1988). Isolation of protoplasts from the marine brown algae Dictyotaceae. Nippon Siusan Gakkaishi 54: 1255. KAKKAR, R.K. BHADURI, S. RAI, V.K. & KUMAR, S. (2000). Amelioration of NaCl stress by arginine in rice seedlings: changes in endogenous polyamines. Biol. Plant., 43(3): 419-422. KAPRAUN, D.F. & SHERMAN, S.G. (1989). Strain selection and cell isolation of Ulva oxysperma (Kuetz) Bliding (Chlorophyta) for net cultivation. Hydrobiologia 179: 53 – 60. KAUR-SHAWNEY, R. & APPELWHITE, P.B. (1993). Endogenous protein-bound polyamines: correlation with regions of cell division in tobacco leaves, internodes and ovaries. Pl. Gr. Reg., 12: 223 - 227. KAWASHIMA, Y. & TOKUDA, H. (1990). Callus formation in Ecklonia cava Kjellman (Laminariales, Phaeophyta). Hydrobiologia, 204/205: 375 - 380. KAWASHIMA, Y. & TOKUDA, H. (1993). Regeneration from callus of Undaria pinnatifida (Harvey) Suringar (Laminariales, Phaeophyta). Hydrbiologia, 260/261: 385 – 390. KELLER, M.D., SELVIN, R.C., CLAUS, W. & GUILLARD, R.R.L. (1987). Media for the culture of oceanic ultra phytoplankton. J. Phycol., 23: 633 – 638. KEVERKORDES, K. BEARDALL, J. & CLAYTON, M.N. (1993). A novel method for extracting protoplasts from large brown algae. J. Exp. Bot., 44: 1587 - 1593. KIMURA, H. NOTOYA, M. & MASAHIRO, N. (1997). Tissue culture of Undaria undarioides (Yendo) Okamura (Phaeophyta, Laminariales). J. Mar. Biotechnol., 5: 100102. KIRIHARA, S. FUJIKAWA, Y. & NOTOYA, M. (1997). Axenic tissue culture of Sargassum confusum C. Agardh (Phaeophyta) as a source of seeds for artificial marine forests. J. Mar. Biotechnol., 5: 142-146. KITO, H. KUNIMOTO, M. KAMANISHI, Y. & MIZUKAMI, Y. (1998). Protoplast fusion between Monostroma nitidum and Porphyra yezoensis and subsequent growth of hybrid plants. J. Appl. Phycol., 10: 1 – 21. KLOAREG, B. & QUATRANO, R.S. (1987). Isolation of protoplasts from zygotes of Fucus disticus (L.) Powell (Phaeophyta). Pl. Sci. 50: 189 – 194.

108

KLOAREG, B. LIU, X.W. BOYEN, C. LE GALL, Y. ZHA, X. & POTIN, P. (1989). Applications of plant biotechnology to the micropropagation and genetic improvement of the economically- interesting marine algae. Oceanis, 15: 649 - 659. KOOISTRA, W.H.C.F. BOELE-BOS, S.A. & STAM, W.T. (1991). A method for obtaining axenic algal cultures using the antibiotic cefotaxime with emphasis on Cladophoropsis membranacea (Chlorophyta). J. Phycol., 27: 656 - 658. KUMAR, G.R.K. ADDEPALLI, M.K. & REDDY, C.R.K. (1999). Regeneration of the thallus of Monostroma oxyspermum (Chlorophyta) from protoplasts in axenic culture. Phycologia, 38 (6): 503-507. KUMAR, G.R.K. REDDY, C.R.K. GANESAN, M. THIRUPPATHI, S. DIPAKKORE, S. ESWARAN, K. ROA, P.V.S. & JHA, B. (2004). Tissue culture and regeneration of thallus from callus of Gelidiella acerosa (Gelidiales, Rhodophyta). Phycologia, 43: 596 – 602. LACLAIRE, J. W. (1982). Wound healing motility in the green alga Ernodesmis: calcium ions and metabolic energy are required. Planta, 156(5): 466 – 474. LARPENT-GOURGAUD, M. & AUMAITRE, MP. (1987). Production et regeneration de protoplasts chez Draparnaldia mutabilis (Chaetophorales, Chlorophyta). Cryptogamie Algologie, 8 (2): 101-106. LAWLOR, H.J. MCCOMB, J.A. & BOROWITZKA, M.A. (1989). Tissue culture of Ecklonia radiata (Phaeophyceae, Laminariales): effects on growth of light, organic carbon sources and vitamins. J Appl. Phycol., 1: 105 - 112. LAWLOR, H.J. BOROWITZKA, M.A. & MCCOMB, J.A. (1990). Tissue culture of brown seaweeds. Aust. J. Biotech. 4: 260-264 LEE, T. (1985). Aposporous gametophyte formation in stipe explants from Laminaria saccharina. Bot. Mar., 28: 179 – 185. LEE, T. M. (1998). Investigations of some intertidal green macroalgae to hyposaline stress: detrimental role of putrescine under extreme hyposaline conditions. Pl. Sci., 138: 1-8. LEWIN, J. (1966). Silicon metabolism in Diatoms. V. Germanium dioxide, a specific inhibitor of diatom growth. Phycologia, 6: 1-12.

109

LEWITUS, A.J. CARON D.A. & MILLER, K.R. (1991). Effects of light and glycerol on the organization of the photosynthetic apparatus in the facultative heterotroph Pyrenomonas salina (Cryptophyceae). J. Phycol., 27: 578 – 587. LIMA, M. KINOSHITA, T. KAWAGUCHI, S. & MIGITA, S. (1995). Cultivation of Grateloupia acuminata (Halymeniaceae, Rhodophyta) by regeneration from cut fragments of basal crusts and upright thalli. J. Appl. Phycol., 7: 583 – 588. LIU, Q.Y. CHEN, L.C.M. & TAYLOR, A.R.A. (1992). Ultrastructure of cell wall regeneration by isolated protoplasts of Palmaria palmata (Rhodophyta). Bot. Mar., 35: 21 - 33. LIU, X.W. & KLOAREG, B. (1991). Tissue culture of Porphyra umbilicalis (Bangiales, Rhodophyta). I: The effects of plant hormones on callus induction from tissue explants. Compte Rendu. Acad. Sci. Paris Ser III., 312: 517 - 522. MARCHANT, H.J. & FOWKE, L.C. (1977). Preparation, culture and regeneration of protoplasts from filamentous green algae. Can. J. Bot., 55: 3080 – 3086. MARIÁN, F.D. GARCÍA-JIMÉNEZ, P. & ROBAINA, R.R. (2000). Polyamines in marine macroalgae, levels of putrescine, spermidine and spermine in thalli and changes in their concentration during glycerol-induced cell growth in vitro. Physiol. Plant., 110: 530 -534. MCLACHLAN, J. (1973). Growth media – marine. In Handbook of Phycological Methods. Culture Methods and Growth Measurements (Stein, J.R. editor), 25 - 51. Cambridge University Press, Cambridge. MCLACHLAN, J. (1977). Effects of nutrients on growth and development of embryos of Fucus edentatus (Phaeophyceaea, Fucales). Phycologia, 16: 329-338. MCLACHLAN, J. CHEN, L.C.-M. & EDELSTEIN, T. (1971). The culture of four species of Fucus under laboratory conditions. Can. J. Bot., 49: 1463 – 1469. MEJJAD, M. LOISEAUX-DE-GONER, S. & DUCREUX, G. (1992). Protoplast isolation, development, and regeneration in different strains of Pilayella littoralis (L.) Kjellm. (Phaeophyceae). Protoplasma, 169: 42 – 48. MILLNER, P.A. CALLLOW, M.E. & EVANS, L.V. (1979). Preparation of protoplasts from the green alga Enteromorpha intestinalis (L.) Link. Planta, 147: 174-177.

110

MOLLET, J.C. VERDUS, M.C. KLING, R. & MORVAN H. (1995). Improved protoplast yield and cell wall regeneration in Gracilaria verrucosa (Huds.) Papenfuss (Gracilariales, Rhodophyta). J. Exp. Bot., 46: 239 - 247. MOONEY, P.A. (1983). Cytokinins in Sargassum heterophyllum under natural and in vitro conditions. M. Sc. Thesis. University of Natal, South Africa. MOONEY, P.A. & VAN STADEN, J. (1984). In vitro plantlet formation and multiple shoot induction in Sargassum heterophyllum. S. Af. J. Bot., 51: 41 - 44. MOORE, L.R. POST, A.F., ROCAP, G. & CHISHOLM, S.W. (2002). Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Limnol. Oceanogr. 47. 989 – 996. MOREL, F.M.M. RUETER, J.G. ANDERSON, D.M. & GUILLARD, R.R.L. (1979). Aquil: A chemically defined phytoplankton culture medium for trace metal studies. J. Phycol., 15: 135 – 141. NEILSON, A.H. & LEWIN, R.A. (1974). The uptake and utilization of organic carbon by algae: an assay in comparative biochemistry. Phycologia, 13: 227 - 264. NOEL, M.-H. KAWACHI, M. & INOUVE, I. (2004). Induced dimorphic life cycle of a coccoliyhophorid, Calyptrosphaera sphaeroidea (Prymnesiophyceae, Haptophyta). J. Phycol., 40: 112 – 129. NOTOYA, M. KIKUCHI, N. & ARUGA, Y. (1992). Porphyra kinositae (Yamada et tanaka) Fukuhara (Bangiales, Rhodophyta) in culture. Jap. J. Phycol., 40: 273 – 278. NYS , R. JAMESON , P.E. & BROWN, M.T. (1991). The influence of cytokinins on the growth of Macrocystis pyrifera. Bot. Mar., 34: 465−7. OSBORNE, D.J. & MCMANUS, M.T. (2005). Hormones, signals and target cells in plant development. Cambridge University Press. PACKER, M.A. (1994). Protoplast formation from single cells and small tissue fragments of wild Porphyra fronds (Rhodophyta). Bot. Mar., 37 (2): 101 - 108. PEDERSEN, P.M. (1968). Ectocarpus fasciculatus: marine brown alga requiring kinetin. Nature, 218: 776. PEDERSEN, P.M. (1979). Culture studies on the brown algae Halothrix lumbricalisi and Elachista fucicola (Elachistaceae). Bot. Notiser., 132: 151 - 159. PEÑA, L. (2005). Transgenic plants. Methods and Protocols. In: Methods in molecular biology. Vol. 286. Peña L (ed). Humana Press. NY

111

POLNE – FULLER, M. (1988). The past, present and future of tissue culture and biotechnology of seaweeds, In Algal Biotechnology (Stadler, T. Mollion, J. Verdus, M. C. Karamanos, Y. Morvan, H. Christan, D., editors), 111-118. Elesevier Applied science, London, NY. POLNE-FULLER, M. & GIBOR, A. (1984). Developmental studies in Porphyra. I. Blade differentiation in Porphyra perforate as expressed by morphology, enzymatic digestion, and protoplast regeneration. J. Phycol., 20: 609 - 616. POLNE – FULLER, M. & GIBOR, A. (1987). Callus and callus like growth in seaweeds: induction and culture. Proc. Int. Seaweed Symp. 12: 131-138. POLNE – FULLER, M. GIBOR, A. & NEUSHUL, M. (1980). The use of ultrasound for removal of macroalgal epiphytes. Bot. Mar., 23: 731 – 734. POLNE – FULLER, M. BINIAMINOV, M. & GIBOR, A. (1984). Vegetative propagation of Porphyra perforata. Hydrobiologia, 116/7: 38 - 313. POLNE – FULLER, M. SAGA, N. & GIBOR, A. (1986). Algal cell, callus, and tissue cultures and selection of algal strains. In: Algal Biomass Technologies- An Interdisplinary Perspective (Barclay, W.R. McIntosh, R. M., editors). Nova Hedwigia, 83: 30 – 36. PROVASOLI, L. (1957). The development of artificial media for marine algae. Archiv fur Mikrobiologie 25: 392-428. PROVASOLI, L. (1968). Media and prospects for the cultivation of marine algae. In: Cutures and Collections of Algae (Watanabe, A. Hattori, A., editors), 63-67. Japanese Society of Plant Physiologists, Tokyo. PROVASOLI, L. & CARLUCCI, A. F. (1974). Vitamins and growth regulators. In: Algal Physiology and biochemistry (Steward, W.D.P., editor), 741-747. Botanical Monographs. PROVASOLI, L. & PINTNER, I.J. (1980). Bacteria induced polymorphism in an axenic laboratory strain of Ulva lactuca (Chlorophyceae). J. Phycol., 16: 196 – 201. PROVASOLI, L. MCLAUGHLIN, J.A. & DROOP, M.R. (1957). The development of artificial media for marine algae. Arch. Microbiol., 25(4): 392 – 428.

112

PRICE, N.M. HARRISON, G.L. HERING, J.G. HUDSON, R.J. NIREL, P.M.V. PALENIK, B. & MOREL, F.M.M. (1989). Preparation and chemistry of the artificial culture medium. Aqui. Biol. Oceanogr., 6: 443 – 461. RAVEN, J.A. (1984). Energetics and Transport in Aquatic Plants. In: MLB Lectures in Biology, 587pp., Vol. 4. Alan R. Liss Inc., New York. REDDY, C.R.K. MIGITA, S. & FUJITA, Y. (1989). Protoplast isolation and regeneration of three species of Ulva in axenic culture. Bot. Mar., 32: 483 – 490. REDDY, C.R.K. LIMA, M. & FUJITA, Y. (1992). Induction of fast growing and morphologically different strains through intergeneric protoplast fusions of Ulva and Enteromorpha (Ulvales, Chlorophyta). J. Appl. Phycol., 4: 57 – 65. REDDY, C.R.K. RAJAKRISHNAKUMAR, G. SIDDHANTA, A. K. & TEWARI, A. (2003). In vitro somatic embryogenesis and regeneration of somatic embryos from pigmented callus of Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty (Rhodophyta, Gigartinales). J. phycol., 39: 610 – 616. REED, R.H. (1985). Osmoacclimation in Bangia atropurpurea (Bangiales): the osmotic role of floridoside. Br. Phycol. J., 20: 211 - 218. REED, R.H. COLLINS, J.C. & RUSSELL, G. (1980). The effects of salinity upon galactosyl glycerol content and concentration of the marine red alga Porphyra purpurea. J. Exp. Bot., 31: 1539 - 1554. REY, M. DÍAZ-SALA, C. & RODRÍGUEZ, R. (1994). Comparison of endogenous polyamine content in hazel leaves and buds between the annual dormancy and flowering phases of growth. Physiol. Plant., 91: 45 - 50. RIETEMA, H. (1973). The influence of day length on the morphology of the Halicystis parvula phase of Derbasia tenuissima (De. Not.)Crn. (Chlorophyceae, Caulerpales). Phycologia, 12: 11 – 16. RIPPKA, R. (1988). Isolation and purification of cyanobacteria. Methods Enzymol., 167: 3 - 27. ROBAINA, R.R. GARCÍA-JIMÉNEZ, G. & LUQUE, A. (1990a). Morphogenetic effect of glycerol on tissue cultures of the red seaweed Grateloupia doryphora. J. Appl. Phycol., 2: 137 – 143.

113

ROBAINA, R.R. GARCIA-REINA, G. & LUQUE, A. (1990b). The effects of the physical characteristics of the culture medium on the development of red seaweeds in tissue culture. Hydrobiologia, 204/205: 137 – 142. ROBAINA, R.R. GARCIA-REINA, G. & LUQUE, A. (1992). The growth pattern and structure of callus from the red alga Laurencia sp (Rhodophyta, Ceramiales) compared to shoot regeneration. Bot. Mar., 35: 267 - 272. ROBAINA, R.R. GARCÍA-JIMÉNEZ, P. BRITO, I, & LUQUE, A. (1995). Light control of the respiration of exogenous glycerol in the red macroalga Grateloupia doryphora. Eur. J. Phycol., 30: 81 – 86. ROBERTS, D.R. DUMBROFF, E.B. & THOMPSON, J.E. (1986). Exogenous polyamines alter membrane fluidity in bean leaves. A basis for potential misinterpretation of their true physiological role. Planta, 167: 395 - 401. RODDE, R.S. OSTGAARD, K. & LARSEN, B. (1997). Chemical composition of protoplasts of Laminaria digitata (Phaeophyceae). Bot. Mar., 40: 385 - 390. RORRER, G.L. & CHENEY, D.P. (2004). Bioprocesses engineering of cell and tissue cultures for marine seaweeds. Aquac. Eng., 32: 11 - 41. RUSSIG, A.M. & COSSON, J. (2001). Plant regeneration from protoplasts of Enteromorpha intestinalis (Chlorophyta, Ulvophyceae) as seedstock for macroalgal culture. J. Appl. Phycol., 13: 103-108. SACRAMENTO, A.T. GARCÍA-JIMÉNEZ, P. ALCÁZAR, R. TIBURCIO, A.F. & ROBAINA, R.R.(2004). Influence of polyamines on the sporulation of Grateloupia (Halymeniaceae, Rhodophyta). J. Phycol., 40: 887-894. SAGA, N. (1984). Isolation of protoplasts from edible seaweeds. Bot. Mag. Tokyo., 97: 423 – 427.

SAGA, N. & SAKAI, Y. (1978). Clone Laminaria from single isolated cell. Bull. Jap. Soc. Sci. Fish., 44: 87. SAGA, N. & SAKAI, Y. (1982). A new method for pure culture of macroscopic algae, the one step selection method. Jap. J. Phycol., 30: 40 – 43. SAGA, N. & SAKAI, Y. (1983). Axenic tissue culture and callus formation of the marine brown alga Laminaria angustata. Bull. Jap. Soc. Sci. Fish., 49: 1561-1563. 114

SAGA, N. & SAKAI, Y. (1984). Isolation of protoplasts from Laminaria and Porphyra. Bull. Jap. Soc. Scin. Fish., 50 (6): 1085. SAGA, N. & KUDO, T. (1989). Isolation and culture of protoplasts from the marine green alga Monostroma angicava. J. Appl. Phycol., 1: 25 – 30. SAGA, N. UCHIDA, T. & SAKAI, Y. (1978). Clone Laminaria from single isolated cells . Bull. Jap. Soc. Scient. Fish., 44: 87 SAGA, N. MOTOMURA, T. & SAKAI, Y. (1982). Induction of callus from the marine brown alga Dictyosiphon foeniculaceus. Pl. Cell Physiol., 23: 727 – 730. SAGA, N. POLNE-FULLER, M. & GIBOR, A. (1986). Protoplasts from seaweeds: production and fusion. In Algal Biomass technologies: An Interdesciplinary perspective (Barclay, W.R. McIntosh, R.M.., editors). Nova Hedwegia 83: 37-43. SAHOO, D.B. (2000). Farming the Ocean: seaweeds cultivation and utilization. Aravali Booka International, New Delhi. SAHOO, D.B. (2001). Tissue culture studies in some tropical seaweeds. Phycologia, 40(4): 44. SAHOO, D.B. (2002). Towards a blue revolution in the sea. In Advances and Marine and Antarctic Sciences (Sahoo, D.B. Pandey, P.C., editors) 1-19. APH Publishing corporation, New Delhi. SAHOO, D.B. & OHNO, M. (2003). Culture of Kappaphycus alvarezii in deep seawater and nitrogen enriched medium. Bull. Mar. Sci. Fish. Kochi. Univ., 22: 89 – 96. SAHOO, D.B. & YARISH, C. (2005). Mariculture of seaweeds. In Algal Culturing Techniques (Anderson, R.A., editor), 219 – 237. Elsevier Academic Press, Phycological Society of America. SAHOO, D.B. OHNO, M. & HIRAOKA, M. (2002). Laboratory, field and deep seawater culture of Eucheuma serra – a high lectin yielding red alga. Algae, 17(2): 127 – 133. SAHOO, D.B. BAWEJA P. & KUSHWAH N. (2006). Developmental studies in Porphyra vietnamensis - a high temperature resistant species from Indian Coast. J. Appl. Phycol. In press.

115

SAUNDERS, G.W. (1972). Potential heterotrophy in a natural population of Oscillatoria agardhii var Isothrix skuja. Limnol. Oceanogr., 17: 704 – 711. SAWABE, T. & EZURA, Y. (1996). Regeneration from Laminaria japonica Areschoug (Laminariales, Phaeophyceae) protoplasts isolated with bacterial alginase. Pl. Cell Reports,17(2) : 892-895. SAWABE, T. EZURA, Y. & YAMAMOTO, H. (1997). Plant regeneration from protoplasts of Laminaria japonica Aresschoug (Laminariales, Phaeophyceae) in a continous-flow culture system. Pl. Cell Reports, 17: 109-112. SCHAEFFER, W.I. (1990). Terminology Associated with Cell, Tissue and Organ Culture, Molecular Biology and Molecular Genetics. In vitro Cell. Dev. Biol., 26: 97101. SCHUBERT, F. HONG, K. DÜZGÜNES, N. & PAPAHADJOPOULOS, D. (1983). Polyamines as modulators of membrane fusion: aggregation and fusion liposomes. Biochemistry, 22: 6134 - 6140. SIVAN, A., VAN MOPPES, D. (MALIS) & ARAD, S. (1992). Protoplast production from the unicellular red alga Porphyridium sp. (UTEX 637) by an extracellular bacterial lytic preparation. Phycologia, 31: 253 – 261. SLOCUM, R.D. KAUR-SHAWNEY, R. & GALSTON, A.W. (1984). The physiology and biochemistry of polyamines in plants. Arch. Biochem. Biophys., 235(2): 283 - 303. STEIN, J.R. (1973). Handbook of phycological methods. Culture methods and growth measurements. Cambridge Univ. Press. Cambridge. STEWARD, F. C. (1983). Reflections on aseptic culture. In Handbook of plant cell culture. Techniques for propagation and breeding (Evans, D. A. Sharp, W. R. Ammirato, P. V. Yamada, Y. editors), 1-10. McMillan Publications Com. New York. SUBBARAJU, D.P. RAMAKRISHNA, T. SREEDHARA & MURTHY, M. (1981). Effects of some growth regulators on Gracilaria corticata, an agarophyte. Aq. Bot., 10: 75 – 80. TATEWAKI, M. (1966). Formation of crustaceous sporophyte with unilocular sporangia in Scytosiphon lomentaria. Phycologia, 6: 401 – 403.

116

TATEWAKI, M. & NAGATA, K. (1970). Surviving protoplasts in vitro and their development in Bryopsis. J. Phycol., 6: 401 – 403. TATEWAKI, M. PROVASOLI, L. & PINTNER, I. J. (1983). Morphogenesis of Monostroma oxyspermum Kütz.) Doty (Chlorophyceae) in axenic culture, especially in bialgal culture. J. Phycol.,19: 409 – 416. TOMPKINS, J. DEVILLE, M. M., DAY, J. G. & TURNER, M. F. (1995). Culture Collection of Algae and Protozoa, Catalogue of Strains, 6th edn. The Foundation of the Culture and Collection of Algae and Protozoa, Cumbria. TOKUDA, H. & KAWASHIMA, Y. (1988). Protoplast isolation and culture of a brown alga, Undaria pinnatifida. In Algal Biotechnology (Stadler, T. Mollion, J. Verdus, M.C. Karamanos, Y. Morran, H. Christiaen, D., editors), 151 – 157. Elsevier Applied Science Publishers Ltd. UPPALAPATI, S.R. & FUJITA, Y. (2002). A simple method for mass isolation of protoplasts from species of Monostroma, Enteromorpha and Ulva (Chlorophyta, Ulvales). J. Appl. Phycol., 14: 165-168. VON STOSCH, H. (1963). Wirkungen von jod un arsenit auf meerasalgen in kultur. Proc. Int. Seaweed Symp., 4: 142 – 150. WAALAND, J.R. DICKKSON, L.G. & WATSON, B.A. (1990). Protoplast isolation and regeneration in the marine red alga Porphyra nereocystis. Planta, 181: 522 – 528. WAALAND, J.R. STILLER, J.W. & CHENEY, D.P. (2004). Macroalgal candidates for genomics. J. Phycol., 40: 26 – 33. WALKER, T.L., COLLET, C., & PURTON S. 2005. Algal transgenic in the genomic era. J. Phycol., 41: 1077 - 1093. WATERBURY, J.B. WATSON, S.W. VALOIS, E.W. & FRANKS, D.G. (1986). Biological and ecological characterization of the marine unicellular cyanobacterium Synecbococcus. In Photosynthetic Picoplankton, (Platt, T. Li, W.K.W. editors), 71 – 120. Can. Bull. Fish. Aquatic Sci. 214. Dept of Fisheries & Oceans, Ottawa, Canada. WANG, X. H. QIN, S. & ZENG, C. (1999). Highly efficient callus induction of Laminaria japonica. Oceanologia et limnologia sinica/Haiyang Yu Huzhao. Qingdao 30 (6): 625 -657.

117

WALNE, P.R. (1970). Studies on the food value of nineteen genera of algae to juvenile bivalves of the genera Ostra. Crassostrea, Mercenaria and Mytilus. Fish. Invest. London, Serie., 2, 24(5): 1–62. WEAST, R.C. LIDE, D.R. ARTLE, M.J. & BEYER, W.H. (1989). CRC Handbook of Chemistry and Physics. CRC Press, Inc., Boca-Raton, FL. WOOLERY, M.L. & LEWIN, R.A. (1973). Influence of iodine on growth and development of the brown alga Ectocarpus siliculosus in axenic culture. Phycologia, 12: 131-138. WU, S. (1985). Isolation and culture of protoplasts from Undaria pinnatifida. M.Sc. thesis. Shandong Coll. Of Oceanogr., Quingdai, R.R. China. WU, S. (1988). Isolation and culture of protoplasts from Undaria pinnatifida (Harv.) Suringar. J. Ocean Univ. Quingdao 18: 57-65. XING-HONG, Y. & WANG, S-J. (1993). Regeneration of whole plants from Gracilaria asiatica Chang et Xia protoplasts (Gracilariaceae, Rhodophyta). Hydrobiologia, 260/261: 429-436. XUE-WU, L. GORDON, E. (1987). Tissue and cell culture of New Zealand Pterocladia and Porphyra species. Hydrobiologia, 151/152: 147 – 154. YAN. Z.M. (1984). Studies on tissue culture of Laminaria japonica and Undaria pinnatifida. Hydrobiologia, 116/117: 314 – 316. YOKOYA, N.S. (2000). Apical callus formation and plant regeneration controlled by plant growth regulators on axenic culture of the red alga Gracilariopsis tenuifrons (Gracilariales, Rhodophyta). Phycol. Res., 48: 133 - 142. YOKOYA, N.S. & HANDRO, W. (1996). Effects of auxins and cytokinins on tissue culture of Grateloupia dichotoma (Gigartinales, Rhodophyta). Hydrobiologia, 326/327: 393 - 400. YOKOYA, N.S. & HANDRO, W. (2002). Effects of plant growth regulators and culture medium on Morphogenesis of Solieria filiformis (Rhodophyta) cultured in vitro. J. Appl. Phycol., 14: 97 - 102. YOKOYA, N.S. GUIMARAES, S. M. P. B. & HANDRO, W. (1993). Development of callus like structures and plant regeneration in thallus segmentrs of Grateloupia filiformis Kutzing (Rhodophyta). Hydrobiologia, 260/261: 407 - 413.

118

YOKOYA, N. S. WEST, J. A. & LUCHI, A. E. (2004). Effects of plant growth regulators on callus formation, growth and regeneration in axenic tissue cultures of Gracilaria tenuistipitata and Gracilaria perplexa (Gracilariales, Rhodophyta). Phycol. Res., 52: 244 - 254. YOKOYA, N.S. KAKITA, H. OBIKA, H. & KITAMURA, T. (1999). Effects of environmental factors and plant growth regulators on growth of the red alga Gracilaria vermiculophylla from Shikoku Island, Japan. Hydrobiologia, 398/399: 339 - 347. YOSHIDA, G. YOSHIKAWA, K. & TERAWAKI, T. (2001). Artificial seedling of Sargassum macrocarpum developed from adventive embryos. Fish. Sci., 67: 352 – 354. YOSHIDA, G. UCHIDA, T. ARAI, S. & TERAWAKI, T. (1999). Development of adventive embryos in cauline leaves of Sargassum macrocarpum (Fucales, Phaeophyta). Phycol. Res., 47(1): 61-64. ZHANG, D. (1982). Some experiments and observations on the tissue and cell culture of Undaria pinnatifida. J. Shandong Cell. Oceanogr., 12: 29-38. ZHANG, D. (1983). Study on the protoplast preparation, culture and fusion of somatic cells of two species of green algae – Ulva linza and Monostroma angicava Kjellm. J. Shandong Coll. Oceanogr., 13: 57 - 65 ZUO-MEI, Y. (1984). Studies on tissue culture of Laminaria japonica and Undaria pinnatifida, Hydrobiologia, 116/117: 314 - 316.

119

Listado cronológico de la utilización de los reguladores de crecimiento (PGR) en el cultivo in vitro de macroalgas. BA, benzyladenina; 2-4 D, 2-4 diclorofenoxiacético; 2,4,5-T, 2,4,5 triclorofenoxiacético; GA3, ácido giberélico IAA, ácido indole-3-acético; iP, isopentenyladenina; Kin, Kinetina; NAA, ácido naphthalenacético; PAA, ácido fenoxiacético; PUT, putrescina; SPD, espermidina; SPM, espermina

Referencia

PGR

Especie

Efecto generado

Provasoli, 1957 Kin , IAA

Ulva lactuta

Crecimiento filamentoso

Jennings, 1969

Kin

Ecklonia e Hyphea

Crecimiento

Dawes, 1971

IAA

Caulerpa prolifera

Crecimiento

Pedersen, 1968

Kin

Ectocarpus fasciculatus Dilophus fasciola Stypocaulon scoparium Ceramium ciliatum Porphyra leucosticta

Morfogénesis de rizoides Crecimiento Crecimiento Retraso de la senescencia Retraso de la senescencia

Augier, 1976 Kin

Fries & Iwasaki, 1976

PAA, OHPAA

Porphyra tenera

Crecimiento

Fries, 1977

Fucus spiralis

Crecimiento y morfogénesis (ramificación)

Dworetzky et al., 1980

OH-PAA and PAA Kin or GA3 + Kin

Sphacelaria furcigera

Crecimiento y división celular

Mooney, 1983

Kin

Sargassum heterophyllum Crecimiento y división celular

Zhang, 1982

NAA

Undaria pinnatifida

Inducción de callo

Fries, 1984

IAA, PAA, OH-PAA

Fucus spiralis

Crecimiento y morfogénesis (formación de plántula)

Gusev et al., 1987

Kin

Gracilaria verrucosa y Furcellaria fastigiata

Inducción de callo

Fries, 1988

IAA, iP, Zeatine

Ascophyllum nodosum

Crecimiento

Bradley & Cheney, 1990

PAA, Zeatin, BA, NAA, IAA, 2,4,5-T

Agardhiella subulata

División celular y crecimiento

Nys et al., 1991 Zeatin, iP

Macrocystis pyrifera

Crecimiento

Liu & Kloareg, 1991

NAA, Kin

Porphyra umbilicalis

Inducción de callo

Kaczyna &

IAA, IPA,

Gracilaria verrucosa

División celular

120

Megnet, 1993

iP

Amano & Noda, 1994

Zeatin

Ulva Pertusa

Crecimiento

García-Jiménez Kin, 2-4, D, et al., 1998 PUT, SPD, SPM

Grateloupia doryhora (sporelings)

Inducción de callo, regeneración de nuevos ejes

Yokoya et al., 1999

IAA, 2,4-D, BA

Gracilaria vermiculophylla

Inducción de callo

Hemalatha & Rengansamy, 1999

Kin

Gracilaria edulis

Crecimiento

Joseph & Chennubhotla, 1999

GA, 2-4-D

Gracilaria coricata, Hypnea valentiae, Ulva fasciata

Crecimiento

Marián et al., 2000 b

PUT, SPD, SPM

Grateloupia doryphora (sporelings)

Formación de masas celulares en medios con glicerol

GuzmánUrióstegui et al., 2002

PUT, SPD, SPM

Gracilaria cornea

esporulación

Yokoya & Handro 2002

IAA, 2,4-D, BA

Solieria filiformis

Crecimiento y regeneración

Hurtado & Cheney, 2003

NAA, NAA +BA

Eucheuma denticulatum

Inducción de callo

Sacramento et al., 2004

PUT, SPD, SPM

Grateloupia sp

esporulación

Yokoya et al.. 2004

IAA, 2,4-D

Gracilaria tenuistipitata

Inducción de callo

121

122

Agentes químicos utilizados como esterilizantes en el cultivo de tejidos de algas. Los procedimientos de esterilización comienzan con un agente primario de amplio espectro y un surfactante. A continuación procede una incubación con antibióticos de acción bacteriana, fúngica, y anti-diatomeas. Las concentraciones empleadas difieren según los autores, sugiriéndose su ajuste de acuerdo a la especie.

Tratamiento

Efecto

Tiempo de

Referencias

incubación Primario

Surfactante Triton X – 100, Agryrol, Linbro R 7x

Gibor & Izawa, 1963; Chen, 1986, 1989.

Antiséptico general Alcohol, Chlorohexidine digluconate

Saga & Sakai, 1983; Gusev et al., 1987.

Agentes oxidantes Ca (OCl)2, NaOCl, H2O2, KI - I2, Soluciones

Fries, 1963; Druehl & Hsiao, 1969; Fries, 1980;

de yodo comercial (i.e. Betadine or Jodopax)

Polne-Fuller et al., 1980; Gibor et al., 1981;; Reddy et al., 1989.

Secundario Bactericida

Estreptomicina, Kanamicina, Gentamicina,

Días ( 2 a 7)

Chen &Taylor,1978; Polne - Fuller & Gibor,

Neomicina, Penicilina, Ampicilina,

1984; Fisher & Gibor, 1987; Xu – Wu &

Ciproflaxicina

Gordon, 1987; Kajiwara et al., 1988; Kloareg et al., 1989; Kawashima & Tokuda, 1990Robaina et al., 1990; Yokoya et al., 1993; Chen & Chiang, 1994; Yokoya & Handro, 1996; Yokoya et al., 1999; Yokoya, 2000; Russig & Cosson, 2001; Reddy et al., 2003.

Carbenicilina, Polymixina B, Rifampicina,

Horas (5 a 48)

Cloranfenicol

Druehl & Hsiao, 1969; Saga & Sakai, 1982; Cheney et al., 1986; Butler et al., 1989; Yokoya et al., 1999; Russig & Cosson, 2001.

Fungicida Nistatina

124

Días (2 a 7) en la

Polne - Fuller & Gibor, 1984, 1987; Fisher &

misma solución

Gibor, 1987; Tokuda & Kawashima, 1988;

bactericida

Kloareg et al., 1989; Robaina et al., 1990 a, b, 1992; Chen & Chiang, 1994; García-Jiménez et al., 1996, 1998, 1999; Yokoya & Handro, 1996; Yokoya et al., 1999; Yokoya, 2000; Reddy et al., 2003.

Anti-diatomeas Dióxido de germanio

Días (2 a 7) en la

Lewin, 1966; Gall et al., 1990; García-Jiménez

misma solución

et al., 1996, 1998, 1999; Robaina et al., 1990 a,

bactericida

b, 1992; Marián et al., 2000 b; GuzmánUrióstegui et al., 2002; b; Sacramento et al., 2004.

125

Condiciones generales empleadas en el cultivo de tejidos de algas con y sin interés comercial. Los detalles se refieren al medio de cultivo, regulador de crecimiento ((RC), adición de azúcares, irradiancia (I), temperatura (º C), fotoperiodo (L:D), fuente de explanto y, desarrollo. MACROALGAS COMERCIALES ______________________________________________________________________________________________________________________ Género

Medio

Azúcar

I

Temp.

L:D

Fuente

(0 C)

Desarrollo

Tejido

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ _ ALGAS VERDES Ulva taeniata

MPES

(+)

Protoplasto

Fusión heteroplásmica, Callo

Zhang, 1983

U. linza

MPES

Protoplasto

Fusión heteroplásmica, Callo

Zhang, 1983

U. pertusa

PES

Talos

Saga, 1984

U. pertusa

PES

3000 Lux

20

12:12

Talos

Fujita & Migita, 1985

U. taeniata

PES I

20–60PFD

18

12:12

Callos y Talos

Polne – Fuller et al., 1986

U. augusta

SW,PES

60 PFD

18

12 :12

Callos y Regeneración

Polne – Fuller & Gibor, 1987

U. conglobata

f/2

40 PFD

20 – 21

12 : 12

Fusión heteroplásmica, Callo

Reddy et al., 1989

U. pertusa

f/2

40 PFD

20 – 21

12 : 12

Fusión heteroplásmica, Callo

Reddy et al., 1989

U. pertusa

PES

1000–6000 Lux

14-18

14 : 10

Talos

Fujimara et al., 1989

U. conglobata

f/2

60 PFD

20

12 : 12 Protoplasto

Talos

Reddy et al., 1989

(+)

(-)

(-)

Segmento talo

126

U. fasciata

f/2

60 PFD

20

12 : 12

Protoplasto

Talos

Reddy et al., 1989

U. pertusa

f/2

60 PFD

20

12 : 12

Protoplasto

Talos

Reddy et al., 1989

U. fasciata

PES

Células

Talos

Kaproun & Sherman, 1989

U. rigida

PES

60 PFD

20

12 : 12

Callos y Talos

Reddy et al, 1989

U. pertusa

f/2

40-80PFD

20

12 : 12

Fusión heteroplásmica, Talos

Reddy et al., 1992

U. fasciata

PES

40-160 umolm-2s-1

24

12 : 12

Talos

Chen & Shih, 2000

Ulva spp.

ESW

(+)

40 umolm-2s-1

20

12:12

Uppalapati & Fujita, 2002

ALGAS PARDAS Laminaria angustata

PES I

L. digitata

ASP6F2

(-)

L. hyperborea

ASP6F2

(-)

L. groenlandica

ESP

Explantos

Filamentos

Druehl & Boalch, 1981

L. setchelli

ESP

Explantos

Filamentos

Druehl & Boalch, 1981

14 : 10

Explantos

Talos

Callos y Filamentos

L. angustata

ASP12NTA, PES

L. japonica

Modified MS

Células

(-)

14 w m-2

(-) (-)

(-)

11

Esporofilo

Saga & Sakai, 1978

14 : 10

14 w m-2

11

2000Lux

14 : 10

14

127

Fries, 1980 Fries, 1980

Callos

Saga & Sakai, 1983 Fang et al., 1983

(+)

M & S (s)

L. sacchirina

ASP6F2, PES

L. sinclairii

PES

L. digitata

La

L. japonica

PES

(+)

L. digitata

PES

(-)

Sargassum muticum

PES I

S. fluitans

PES

(-)

(-)

20-60µmol m-2s-1

PES

(-)

(-)

(-)

(-)

2.9 Jm-2s-1

L. japonica

(-)

10 –15

20-60µmol m-2s-1

18 12 : 12

34.2 µmol m-2s-1 (-)

20 µmol m-2s-1

8 : 16

Yan, 1984

Explantos

Callos, Gametofitos

Explantos

Callos y Regeneración

Polne-Fuller & Gibor, 1987

Talos

Callos y Regeneración

Liu & Kloareg, 1991

Talos

Sawabe et al., 1997

5

12 : 12

Protoplasto

12 16 : 8

Talos

Regeneración

Lee, 1985

Asensi et al., 2001

Explantos

Callos y Talos

Polne – Fuller et al., 1986

18

12 : 12

Explantos

Callos

20-60µmol m-2s-1

18

12 : 12

Explantos

Callos y Regeneración

0 – 80 µmol m-2s-

5 – 30

14 : 10

Explantos

Talos

Hojas

Embriones

Yoshida et al., 1999

Tejido cortical

Embriones

Yoshida et al., 2001

Polne-Fuller & Gibor, 1987 S. muticum Polne-Fuller & Gibor, 1987 S. confusum

Modified Grund

S. macrocarpum (-)

S. macrocarpum

(-)

30 µmol m-2s-1

12 : 12

Undaria pinnatifida

PES I

Explantos

Callos y Esporofitos

U. pinnatifida

Modified MS

Explantos

Callos y Regeneración

U. pinnatifida

M & S (s)

(+)

(-)

2.9

10 –15

128

8 : 16

Kirihara et al., 1997

Zhang, 1982 Fang et al., 1983 Yan, 1984

U. pinnatifida

PRS

U. pinnatifida

PES

U. pinnatifida

PES I

(-)

(-)

U. undarioides

ASP12NTA

(-)

(-)

Chondrus crispus

SWMD – 1

(+)

-

Eucheuma alvarezii

PES

(-)

(-)

E. denticulatum

ESS

(X)

-

E. uncinatum

PES

(-)

(-)

E. denticulatum

ESS/2

(+)

-

Gelidium nudifrons

PES

(-)

G. robustum

PES

G. vagum

I

2000 – 2500 Lux 80 µE

20 11 : 13 13

Protoplasto

Plántulas

Wu, 1985

Protoplasto

Plantas juveniles

Wu, 1988

10 : 14

20

Kawashima & Tokuda, 1993 Tejido medular

Kimura et al., 1997

ALGAS ROJAS 100 µE

15

16 : 8

Chen & Taylor, 1978

60 µE

18

12 : 12

Polne-Fuller & Gibor, 1987

12 : 12

Dawes & Koch, 1991

18

12 : 12

Polne-Fuller & Gibor, 1987

10 µmol m-2s-1

25

16 : 8

*

60 µE

18

12 : 12

Polne-Fuller & Gibor, 1987

(-)

*

60 µE

18

12 : 12

Polne-Fuller & Gibor, 1987

MS

((++)

*

500 – 800 Lux

15-20

24 : 0

Gusev et al., 1987

G. canariensis

PES

(-)

(-)

27 µmol m-2s-1

20

16 : 8

García-Jiménez et al.,1999

Gigartina exasperata

PES

(-)

*

18

12 : 12

Polne-Fuller & Gibor, 1987

Gracilaria corticata

SW

(+)

-

G. papenfussii

PES

(-)

(-)

20 – 160 µE 18 – 26 60 µE

60 µE

25-30 60 µE

18

129

Explantos

Explantos 12 : 12

Regeneración

Regeneración

Hurtado & Cheney, 2003

Subbaraju et al., 1981 Polne-Fuller & Gibor, 1987

G. verrucosa

M&S

(+)

*

G. verrucosa

ASP6F2

(+)

(+)

G. vermiculophylla

VSES

(+)

(-)

500 – 800 Lux

15-26

24 : 0

Gusev et al., 1987

18

16 : 8

Kaczyna & Magnet, 1993

20-100 µmol m-2s-1

15 – 30

14 : 10

Explantos

Callos y Regeneración

Yokoya

et al., 1999

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ _ G. cornea

PES

(+)

-

20 µmol m-2s-1 26

8 :; 16

Carpoesporas

Filamentos axiales

(+)

(-)

20 – 30 µmol m-2s-1

21-23

14 : 10

Explantos

Callos y Regeneración

(+)

(+)

40-50 µmol m-2s-1

24 – 26

14 : 10

Explantos

Callos

-

(+)

27 µE

18 : 6

Carpoesporas

Filamentos

Guzmán-Urióstegui et al., 2002 G. tenuistipitata Yokoya et al., 2004 Gracilariopsis tenuifrons

VSES

Yokoya , 2000

ASP12-NTA Grateloupia doryphora

PES

20

Robaina et al., 1990a G. filicina

SWM – 3

18 µmol m-2s-1 22-25

12 : 12

-

-

Chiang, 1993 G. filiformis

VS

-

-

-

130

Yokoya et al., 1993

G. acuminata

PES

(-)

(-)

40-60 µmol m-2s-1

10 – 20

12 : 12

Carpoesporas

Talos

G. dichotoma

ASP12-NTA

(+)

(-)

40-50 µmol m-2s-1

24 – 26

14 : 10

Explantos

Callos y Regeneración

PES

(+)

(-)

30 µmol m-2s-1 18 – 20

18 : 6

Carpoesporas

Regeneración

Kappaphycus alvarezii

ESS

(X)

-

20 – 160 µE

12 : 12

K. alvarezii

ESS; PES

(+)

(-)

5 – 70 µmol m-2s-1

22

Laurencia paniculata

M&S

(+)

*

500 – 800 Lux 15-20

24 : 0

Gusev et al., 1987

Laurencia sp.,

PES

-

-

27 µE

18 : 6

Robaina et al., 1992

Phyllopora nervosa

M&S

(+)

*

500 – 800 Lux 18-26

24:0; 0:24

Gusev et al., 1987

Porphyra lanceolata

PES

(-)

(-)

60 µE

18

12 : 12

Polne-Fuller & Gibor, 1987

P. nereocystis

PES

(-)

(-)

60 µE

18

12 : 12

Polne-Fuller & Gibor, 1987

P. perforata

PES

(-)

(-)

60 µE

18

12 : 12

Polne-Fuller & Gibor, 1987

P. umbilicalis

La

(+)

-

20 – 35 µE

18

12 : 12

Liu & Kloareg, 1991

(-)

(-)

40 µmol m-2s-1 20 – 32

Lima et al., 1995

Yokoya & Handro, 1996 G. doryphora Garcia Jiménez et al., 1998 18 – 26

Dawes & Koch, 1991 12 : 12

Explantos

Callos y Regeneración

Reddy et al., 2003

20

ASP 12-NTA P. vietnamensis

f/2, PES, ASW

131

12:12

Explantos

Chonchoesporas y Talos

Sahoo et al., 2006 ALGAS VERDES Boergesenia forbessi

PES

Bryopsis plumose

PES

Caespitella pascher

BE

(-)

(+)

20 – 22 23 PFD

14:10

Protoplasto

Talos

Enomoto & Hirose,1972

Protoplasto

Plantas

Tatewaki & Nagata, 1970

18

Talos

Larpent – Gourgaud & Aumaitre, 1987 Lee et al., 1989

Chaetomorpha linum Darparnaldia mutabilis

BE

33 PFD

18

Talos

Larpent – Gourgaud & Aumaitre, 1987

D. mutabilis

BE

23 PFD

18

Talos

Larpent – Gourgaud & Aumaitre, 1987

Derbesia tenuissima

Erdshreiber

Talos

Rietema, 1973

Callos y Talos

Fujimara & Kajiwara, 1990

Protoplasto

Enteromorpha compressa f/2

1000-6000lux

14 – 18

14:10

Saga et al., 1986

E. intestinalis E. intestinalis

PES I

E. intestinalis

SW,PES

(-)

E. intestinalis

ESP

(+)

(-)

20–60PFD

18

12:12

Protoplasto y Célula Callos y Talos

Polne – Fuller et al., 1986

60 PFD

18

12 :12

Segmento talo

Polne – Fuller & Gibor, 1987

50 molm-2s-1

15

Callos y Regeneración

12:12

Talos

Russig & Cosson, 2001 E. linza

PES

E. linza

PES

3000 Lux

20

12:12

132

Talos

Saga, 1984

Talos

Fujita & Migita, 1985

E. linza

PES I

20–60PFD

18

12:12

Protoplasto y Célula Callos y Talos

E. linza

f/2

60PFD

20

12:12

Callos y Talos

Reddy & Fujita, 1991

E. prolifera

f/2

60 PFD

20

12:12

Callos y Talos

Reddy & Fujita, 1991

Enteromorpha spp.

ESW

40 umolm-2s-1

Ernodesmis verticillata

PES

10 – 15 PFD25

Klebsormidium flaccidum Peacock’s

20

12:12 16 : 8

20

16 :8

(+)

Polne – Fuller et al., 1986

Uppalapati & Fujita, 2002 Talos

La Claire, 1982

Protoplasto

Filamentos

Marchant & Fowke, 1977

Protoplasto

Fusión heteroplámica

Zhang, 1983

Talos

Saga, 1984

Callos y Talos

Saga & Kudo, 1989

Monostroma anguicava

MPES

M. zostericola

PES

M. anguicava

PES

38 PFD

Monostroma spp.

ESW

40

Mougeotio sp.

Peacock’s

20

16 :8

Protoplasto

Filamentos

Marchant & Fowke, 1977

Stigeoclonium

Peacock’s

20

16 :8

Protoplasto

Filamentos

Marchant & Fowke, 1977

Uronima gigas

Bourelli

Filamentos

Gabriel, 1970

Valonia ventricosa

PES

Talos

La Claire 1982

(-)

10

molm-2s-1

14:10 20

(+)

Protoplasto 12:12

Protoplasto 10 – 15 PFD

25

16 : 8

ALGAS PARDAS

133

Uppalapati & Fujita, 2002

Agarum cribosum

PES

(-)

(-)

20 - 40µE

15

14 : 10

Cystoseira osmundaceae

PES

(-)

(-)

60µmol m-2s-1

18

12 : 12

Ecklonia radiata

M&S

(+)

(-)

50 µE

15 – 25

24:0; 0:24

Lawlor et al., 1989

Cystophora siliquosa

M&S

(+)

(-)

50 µE

15 – 25

24:0; 0:24

Lawlor et al., 1990

Dictyosiphon foeniculus

ASP-C-1,

(-)

(+)

2000Lux

14

Notoya et al., 1992 Explantos

14 : 10

Callos y Regeneración

Polne-Fuller & Gibor, 1987

Callos

Esporofitos

Saga et al., 1982

Dictyopteris dichototha

Protoplasto

Callos

Kajiwara et al., 1988

D. prolifera

Protoplasto

Callos

Kajiwara et al., 1988

D. undulata

Protoplasto

Callos

Kajiwara et al., 1988

ASP12NTA

Tabla 1. (Cont.) MACROALGAS NO COMERCIALES ______________________________________________________________________________________________________________________ Ecklonia. radiata M&S (+) (-) 50 µE 15 – 25 24:0; 0:24 E. cava

(-)

(-)

160 µE

8 - 23

(+)

(-)

20 – 25 W m –2

15

Lawlor et al., 1989

24:0; 0:24

Kawashima & Tokuda,

1990 Fucus spiralis

ASP6F2

F. distichus

ASW

15 : 9

Cortical Tissue

Talos

Protoplasto

Embrión multicelular

16 : 8

Explantos

Kloareg & Quatrano, 1987 Halothrix lumbricalis

PES

-

-

2.5Klx – 700 Lux

4

Pedersen, 1979

134

Regeneración

Fries, 1977

Macrocystis pyrifera

PES

(-)

(-)

20-60µmol m-2s-1

18

12 : 12

Explantos

Callos y Regeneración

40 – 50 PFD

12 : 12

Protoplasto

Callos

Kloareg et al., 1989

20-60µmol m-2s-1

18

12 : 12

Explantos

Callos

0.8 w m –1

12

12 : 12

Protoplasto

Talos

Mejjad et al., 1992

0.8 w m –1

12

12 : 12

Protoplasto

Talos

Ducreux & Kloareg, 1988

Polne-Fuller & Gibor, 1987 M. pyrifera

PES

Pelvetia fastigiata

PES

(-)

(-)

18

Polne-Fuller & Gibor, 1987 Pilayella littorallis

PES

Sphacelaria sp.

PES

(+)

Zonaria tournefortii

PES

(-)

(-)

12 – 20 µE

18

12 : 12

Aguirre – Lipperheide & Evans, 1993

Agardhiella subulata

f/2

(X)

-

20 µE

19

12 : 12

Bradley & Cheney, 1990

Ceramium kondoi

M&S

(+)

*

500 – 800 Lux 15-26

24 : 0

Gusev et al., 1987

Furcellaria fastigiata

M&S

(+)

*

500 – 800 Lux 15-20

24 : 0

Gusev et al., 1987

Phyllopora nervosa

M&S

(+)

*

500 – 800 Lux 18-26

24:0; 0:24

Gusev et al., 1987

Prionotis lanceolate

PES

(-)

*

60 µE

18

12 : 12

Polne-Fuller & Gibor, 1987

Pterocladia capillaceae

PES

(X)

-

20 - 40 µE

18

16 :: 8

Xu-Wu & Gordon, 1987

Rhodymenia pertusa

M&S

((++)

*

500 – 800 Lux 15-20

24 : 0

Gusev et al., 1987

Smithora naiodum

PES

(-)

(-)

60 µE

12 : 12

Polne-Fuller & Gibor, 1987

ALGAS ROJAS

18

135

Laurencia sp

PES

(-)

(-)

27 µmol m-2s-1 20

16: 8

Solieria filiformis

VSES

(+)

-

40-50 µmol m-2s-1

24 – 26 14 : 10

Yokoya & Handro, 2002

136

Robaina et al. 1990 b

Explantos

Regeneración

ANEXO. Documentos de las conferencias, cursos y talleres

137

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL. Taller de cultivo in Vitro de macroalgas Dr. Rafael Robaina Romero Fisiología y Biotecnología Vegetal Marina Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Islas Canarias España

OLOGÍA VEGETAL. es marinas

omero ogía Vegetal Marina almas de Gran Canaria

Table 1. An overall view of cell and tissue culture of commercial seaweeds and non-commercial seaweeds. Detailed descriptions are made of culture medium, irradiance, temperature and photoperiod as environmental conditions as well as the source of explants, the development obtained and whether the authors mentioned the use of plant growth regulators ______________________________________________________________________________________________________________________ Genera

Medium

Growth

Sugar Irradiance

Regulator

Level

Temp.

L:D

0

( C)

Source

Development

Reference

Tissue

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ GREEN ALGAE Ulva taeniata

MPES

(+)

Protoplast

Heteroplasmic fusion, Callus

Zhang, 1983

U. linza

MPES

(+)

Protoplast

Heteroplasmic fusion, Callus

Zhang, 1983

U. pertusa

PES

Thallus

Saga, 1984

U. pertusa

PES

3000 Lux

20

12:12

Thallus

Fujita & Migita, 1985

U. taeniata

PES I

20–60PFD

18

12:12

Callus & Thallus

Polne – Fuller et al., 1986

U. augusta

SW,PES

60 PFD

18

12 :12

Callus & Regeneration

Polne – Fuller & Gibor, 1987

U. conglobata

f/2

40 PFD

20 – 21

12 : 12

Heteroplasmic fusion & Callus

Reddy et al., 1989

U. pertusa

f/2

40 PFD

20 – 21

12 : 12

Heteroplasmic fusion & Callus

Reddy et al., 1989

U. pertusa

PES

1000–6000 Lux

14-18

14 : 10

Thallus

Fujimara et al., 1989

U. conglobata

f/2

60 PFD

20

12 : 12

Protoplast

Thallus

Reddy et al., 1989

U. fasciata

f/2

60 PFD

20

12 : 12

Protoplast

Thallus

Reddy et al., 1989

U. pertusa

f/2

60 PFD

20

12 : 12

Protoplast

Thallus

Reddy et al., 1989

U. fasciata

PES

Cells

Thallus

Kaproun & Sherman, 1989

U. rigida

PES

60 PFD

20

12 : 12

Callus & Thallus

Reddy et al, 1989

U. pertusa

f/2

40-80PFD

20

12 : 12

Heteroplasmic fusion, Thallus

Reddy et al., 1992

U. fasciata

PES

40-160 umolm-2s-1

24

12 : 12

Thallus

Chen & Shih, 2000

Ulva spp.

ESW

40 umolm-2s-1

20

12:12

(-)

(-)

(+)

Thallus segments

Uppalapati & Fujita, 2002

Table 1. (Cont. ) COMMERCIAL SEAWEEDS _____________________________________________________________________________________________________________________ Genera

Medium

Growth

Sugar Irradiance

Regulator

Temp.

L:D

(0 C)

Level

Source

Development

Reference

Tissue

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ BROWN ALGAE Laminaria angustata

PES I

Cells -2

Sporophylls

Saga & Sakai, 1978

L. digitata

ASP6F2

(-)

(-)

14 w m

11

14 : 10

Fries, 1980

L. hyperborea

ASP6F2

(-)

(-)

14 w m-2

11

14 : 10

Fries, 1980

L. groenlandica

ESP

Explants

Filaments

Druehl & Boalch, 1981

L. setchelli

ESP

Explants

Filaments

Druehl & Boalch, 1981

Explants

Callusing

Saga & Sakai, 1983

Thallus

Callus & Filaments

Fang et al., 1983

L. angustata

ASP12NTA, PES (-)

L. japonica

Modified MS

L. japonica

M & S (s)

L. sacchirina

ASP6F2, PES

L. sinclairii

PES

L. digitata

La

(+)

(-)

(-)

(-)

(-)

2000Lux

2.9 Jm-2s-1

14

`

10 –15

20-60µmol m-2s-1 18

-2 -1

Explants

Callusing & Regeneration

Polne-Fuller & Gibor, 1987

Thallus

Callusing & Regeneration

Liu & Kloareg, 1991 Sawabe et al., 1997

20 µmol m-2s-1

12

16 : 8

Thallus

Regeneration

Asensi et al., 2001

Explants

Callus & Thallus

Polne – Fuller et al., 1986

12 : 12

Explants

Callusing

Polne-Fuller & Gibor, 1987

12 : 12

Explants

Callusing & Regeneration

Polne-Fuller & Gibor, 1987

14 : 10

Explasnts

Thallus

Kirihara et al., 1997

Leaves

Adventive embryo0s

Yoshida et al., 1999

Cortical tissue

Adventive embryos

Yoshida et al., 2001

(-)

Sargassum muticum

PES I

S. fluitans

PES

(-)

(-)

20-60µmol m-2s-1 18

S. muticum

PES

(-)

(-)

20-60µmol m-2s-1 18 -2 -

0 – 80 µmol m s

5 – 30

S. macrocarpum (-)

Lee, 1985

Thallus

PES

(-)

Callus, Gametophytes

Protoplast

L. digitata

S. macrocarpum

Explants

12 : 12

(+)

Modified Grund

12 : 12

Yan, 1984

5

PES

S. confusum

8 : 16

34.2 µmol m s

L. japonica

(-)

14 : 10

30 µmol m-2s-1

12 : 12

Undaria pinnatifida

PES I

Explants

Callus & Sporophytes

Zhang, 1982

U. pinnatifida

Modified MS

Explants

Callusing & Regeneration

Fang et al., 1983

Table 1. (Cont. ) COMMERCIAL SEAWEEDS __________________________________________________________________________________________________________________ Genera

Medium

Growth

Sugar Irradiance

Regulator

Temp.

L:D

(0 C)

Level

Source

Development

Reference

Tissue

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ (+)

(-)

2.9 Jm-2s-1

10 –15

8 : 16

Yan, 1984

U. pinnatifida

M & S (s)

U. pinnatifida

PRS

U. pinnatifida

PES

U. pinnatifida

PES I

(-)

(-)

U. undarioides

ASP12NTA

(-)

(-)

Chondrus crispus

SWMD – 1

(+)

-

100 µE

15

16 : 8

Chen & Taylor, 1978

Eucheuma alvarezii

PES

(-)

(-)

60 µE

18

12 : 12

Polne-Fuller & Gibor, 1987

E. denticulatum

ESS

(X)

-

20 – 160 µE

18 – 26

12 : 12

Dawes & Koch, 1991

E. uncinatum

PES

(-)

(-)

60 µE

18

12 : 12

Polne-Fuller & Gibor, 1987

E. denticulatum

ESS/2

(+)

-

10 µmol m-2s-1

25

16 : 8

Gelidium nudifrons

PES

(-)

*

60 µE

18

12 : 12

Polne-Fuller & Gibor, 1987

G. robustum

PES

(-)

*

60 µE

18

12 : 12

Polne-Fuller & Gibor, 1987

G. vagum

MS

((++)

*

500 – 800 Lux

15-20

24 : 0

Gusev et al., 1987

G. canariensis

PES

(-)

(-)

27 µmol m-2s-1

20

16 : 8

García-Jiménez et al.,1999

Gigartina exasperata

PES

(-)

*

60 µE

18

12 : 12

Polne-Fuller & Gibor, 1987

Gracilaria corticata

SW

(+)

-

G. papenfussii

PES

(-)

(-)

60 µE

18

12 : 12

Polne-Fuller & Gibor, 1987

G. verrucosa

M&S

(+)

*

500 – 800 Lux

15-26

24 : 0

Gusev et al., 1987

G. verrucosa

ASP6F2

(+)

(+)

2-4

18

16 : 8

Kaczyna & Magnet, 1993

G. vermiculophylla

VSES

(+)

(-)

20-100 µmol m-2s-1 15 – 30

2000 – 2500 Lux

20

11 : 13

80 µE

13

10 : 14

20

Protoplast

Plantlets

Wu, 1985

Protoplast

Juvenile plants

Wu, 1988 Kawashima & Tokuda, 1993

Meduulary tissue

Kimura et al., 1997

RED ALGAE

ASP12-NTA

25-30

Explants

Explants

14 : 10

Explants

Regeneration

Regeneration

Callusing & Regeneration

Hurtado & Cheney, 2003

Subbaraju et al., 1981

Yokoya et al., 1999

Table 1. (Cont. ) COMMERCIAL SEAWEEDS _________________________________________________________________________________________________________________ Genera

Medium

Growth

Sugar Irradiance

Regulator

Temp.

L:D

(0 C)

Level

Source

Development

Reference

Tissue

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ G. cornea

PES

G. tenuistipitata Gracilariopsis tenuifrons

VSES

(+)

-

20 µmol m-2s-1

(+)

(-)

20 – 30 µmol m-2s-1 21-23 -2 -1

26

8 :; 16

Carpospores

Axial filamenmts

Guzmán-Urióstegui et al., 2002

14 : 10

Explants

Callusing & Regeneration

Yokoya et al., 2004

Explants

Callusing

Yokoya , 2000

(+)

(+)

40-50 µmol m s

24 – 26

14 : 10

-

(+)

27 µE

20

18 : 6

18 µmol m-2s-1

22-25

12 : 12

-

-

-

ASP12-NTA Grateloupia doryphora

PES

G. filicina

SWM – 3

G. filiformis

VS

-

-

-2 -1

Robaina et al., 1990a Carpospores

Filaments

Chiang, 1993 Yokoya et al., 1993

G. acuminata

PES

(-)

(-)

40-60 µmol m s

10 – 20

12 : 12

Carpospores

Thallus

Lima et al., 1995

G. dichotoma

ASP12-NTA

(+)

(-)

40-50 µmol m-2s-1 24 – 26

14 : 10

Explants

Callusing & Regeneration

Yokoya & Handro, 1996

G. doryphora

PES

(+)

(-)

30 µmol m-2s-1

18 – 20

18 : 6

Carpospores

Regeneration

Garcia Jimenez et al., 1998

Kappaphycus alvarezii

ESS

(X)

-

20 – 160 µE

18 – 26

12 : 12

K. alvarezii

ESS; PES

(+)

(-)

5 – 70 µmol m-2s-1 22

12 : 12

Laurencia paniculata

M&S

(+)

*

500 – 800 Lux

15-20

24 : 0

Gusev et al., 1987

Laurencia sp.,

PES

-

-

27 µE

20

18 : 6

Robaina et al., 1992

Phyllopora nervosa

M&S

(+)

*

500 – 800 Lux

18-26

24:0; 0:24

Gusev et al., 1987

Porphyra lanceolata

PES

(-)

(-)

60 µE

18

12 : 12

Polne-Fuller & Gibor, 1987

P. nereocystis

PES

(-)

(-)

60 µE

18

12 : 12

Polne-Fuller & Gibor, 1987

P. perforata

PES

(-)

(-)

60 µE

18

12 : 12

Polne-Fuller & Gibor, 1987

P. umbilicalis

La

(+)

-

20 – 35 µE

18

12 : 12

Liu & Kloareg, 1991

(-)

40 µmol m-2s-1

20 – 32

12:12

Dawes & Koch, 1991 Explants

Callusing & Regeneration

Reddy et al., 2003

ASP 12-NTA P. vietnamensis

f/2, PES, ASW (-)

Explants

Chonchospores and Thallus

Sahoo et al., 2006

Table 1. (Cont.) NON-COMMERCIAL SEAWEEDS ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Genera

Medium

Growth

Sugar Irradiance

Regulator

Level

Temp.

L:D

(0 C)

Source

Development

Reference

Tissue

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ GREEN ALGAE Boergesenia forbessi

PES

Bryopsis plumose

PES

Caespitella pascher

BE

(-)

(+)

20 – 22 23 PFD

14:10

Protoplast

Thallus

Enomoto & Hirose,1972

Protoplast

Plant

Tatewaki & Nagata, 1970

Thallus

Larpent – Gourgaud & Aumaitre, 1987

18

Chaetomorpha linum

Lee et al., 1989

Darparnaldia mutabilis

BE

D. mutabilis

BE

Derbesia tenuissima

Erdshreiber

33 PFD 23 PFD

18

Thallus

Larpent – Gourgaud & Aumaitre, 1987

18

Thallus

Larpent – Gourgaud & Aumaitre, 1987

Thallus

Rietema, 1973

Callus & Thallus

Fujimara & Kajiwara, 1990

Protoplast

Enteromorpha compressa f/2

1000-6000lux 14 – 18

14:10

E. intestinalis

Saga et al., 1986

E. intestinalis

PES I

20–60PFD

18

12:12

Protoplast & Cell

Callus & Thallus

Polne – Fuller et al., 1986

E. intestinalis

SW,PES

(-)

60 PFD

18

12 :12

Thallus segments

Callus & Regeneration

Polne – Fuller & Gibor, 1987

E. intestinalis

ESP

(+)

Thallus

Russig & Cosson, 2001

E. linza

PES

Thallus

Saga, 1984

E. linza

PES

3000 Lux

20

12:12

Thallus

Fujita & Migita, 1985

E. linza

PES I

20–60PFD

18

12:12

Callus & Thallus

Polne – Fuller et al., 1986

E. linza

f/2

60PFD

20

12:12

Callus & Thallus

Reddy & Fujita, 1991

E. prolifera

f/2

60 PFD

20

12:12

Callus & Thallus

Reddy & Fujita, 1991

Enteromorpha spp.

ESW

40 umolm-2s-1 20

12:12

Ernodesmis verticillata

PES

10 – 15 PFD 25

16 : 8

20

16 :8

Klebsormidium flaccidum Peacock’s

(-)

50umolm-2s-1 15+2

12:12

Protoplast & Cell

Uppalapati & Fujita, 2002

Protoplast

Thallus

La Claire, 1982

Filaments

Marchant & Fowke, 1977

Table 1. (Cont.) NON-COMMERCIAL SEAWEEDS ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Genera

Medium

Growth

Sugar Irradiance

Regulator

Temp.

L:D

(0 C)

Level

Source

Development

Reference

Tissue

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Monostroma anguicava

MPES

(+)

M. zostericola

PES

M. anguicava

PES

38 PFD

10

14:10

Monostroma spp.

ESW

40 µmolm-2s-1 20

12:12

Mougeotio sp.

Peacock’s

20

16 :8

Protoplast

Filaments

Marchant & Fowke, 1977

Stigeoclonium

Peacock’s

20

16 :8

Protoplast

Filaments

Marchant & Fowke, 1977

Uronima gigas

Bourelli

Protoplast

Filaments

Gabriel, 1970

Valonia ventricosa

PES

Thallus

La Claire 1982

(-)

Protoplast

(+) 10 – 15 PFD 25

16 : 8

14 : 10

Protoplast

Heteroplasmic fusion

Zhang, 1983

Thallus

Saga, 1984

Callus & Thallus

Saga & Kudo, 1989 Uppalapati & Fujita, 2002

BROWN ALGAE Agarum cribosum

PES

(-)

(-)

20 - 40µE

15

Cystoseira osmundaceae

PES

(-)

(-)

60µmol m-2s-118

12 : 12

Ecklonia radiata

M&S

(+)

(-)

50 µE

24:0; 0:24

Cystophora siliquosa

M&S

(+)

(-)

50 µE 15 – 25

24:0; 0:24

Dictyosiphon foeniculus

ASP-C-1,

(-)

(+)

2000Lux 14

14 : 10

15 – 25

Notoya et al., 1992 Explants

Callusing & Regeneration

Polne-Fuller & Gibor, 1987 Lawlor et al., 1989 Lawlor et al., 1990

Callus

Sporophytes

Saga et al., 1982

Dictyopteris dichototha

Protoplast

Callus

Kajiwara et al., 1988

D. prolifera

Protoplast

Callus

Kajiwara et al., 1988

D. undulata

Protoplast

Callus

Kajiwara et al., 1988

Filamnets

Regeneration

Pedersen, 1979

ASP12NTA

Elachista fucicola

PES

(-)

(-)

440 Lux

4

12 : 12

Table 1. (Cont.) NON-COMMERCIAL SEAWEEDS _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Genera

Medium

Growth

Sugar Irradiance

Regulator

Ecklonia. radiata

M&S

E. cava Fucus spiralis

ASP6F2

F. distichus

ASW

Halothrix lumbricalis

PES

Level

Temp.

L:D

(0 C)

Source

Development

Reference

Tissue

(+)

(-)

50 µE

15 – 25

24:0; 0:24

Lawlor et al., 1989

(-)

(-)

160 µE

8 - 23

24:0; 0:24

Kawashima & Tokuda, 1990

(+)

(-)

20 – 25 W m –2

15

15 : 9

-

-

2.5Klx – 700 Lux 4 -2 -1

Cortical Tissue

Thallus

Fries, 1977

Protoplast

Multicellular Embryo

Kloareg & Quatrano, 1987

16 : 8

Explants

Regeneration

Pedersen, 1979

20-60µmol m s

18

12 : 12

Explants

Callusing & Regeneration

Polne-Fuller & Gibor, 1987

40 – 50 PFD

18

12 : 12

Protoplast

Callus

Kloareg et al., 1989

20-60µmol m-2s-1 18

12 : 12

Explants

Callusing

Polne-Fuller & Gibor, 1987

0.8 w m –1

12

12 : 12

Protoplast

Thallus

Mejjad et al., 1992

0.8 w m –1

12

12 : 12

Protoplast

Thallus

Ducreux & Kloareg, 1988

(-)

12 – 20 µE

18

12 : 12

Aguirre – Lipperheide & Evans, 1993

(X)

-

20 µE

19

12 : 12

Bradley & Cheney, 1990

M&S

(+)

*

500 – 800 Lux

15-26

24 : 0

Gusev et al., 1987

Furcellaria fastigiata

M&S

(+)

*

500 – 800 Lux

15-20

24 : 0

Gusev et al., 1987

Phyllopora nervosa

M&S

(+)

*

500 – 800 Lux

18-26

24:0; 0:24

Gusev et al., 1987

Prionotis lanceolate

PES

(-)

*

60 µE

18

12 : 12

Polne-Fuller & Gibor, 1987

Macrocystis pyrifera

PES

(-)

M. pyrifera

PES

Pelvetia fastigiata

PES

Pilayella littorallis

PES

Sphacelaria sp.

PES

(+)

Zonaria tournefortii

PES

(-)

Agardhiella subulata

f/2

Ceramium kondoi

(-)

(-)

(-)

RED ALGAE

Table 1. (Cont.) NON-COMMERCIAL SEAWEEDS _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Genera

Medium

Growth

Sugar Irradiance

Regulator

Level

Temp.

L:D

(0 C)

Source

Development

Reference

Tissue

Pterocladia capillaceae

PES

(X)

-

20 - 40 µE

18

16 :: 8

Xu-Wu & Gordon, 1987

Rhodymenia pertusa

M&S

((++)

*

500 – 800 Lux

15-20

24 : 0

Gusev et al., 1987

Smithora naiodum

PES

(-)

(-)

60 µE

18

12 : 12

Polne-Fuller & Gibor, 1987

Laurencia sp

PES

(-)

(-)

27 µmol m-2s-1

20

16: 8

Robaina et al. 1990 b

Solieria filiformis

VSES

(+)

-

40-50 µmol m-2s-1 24 – 26

ASP 12-NTA

14 : 10

Explants

Regeneration

Yokoya & Handro, 2002

Capítulo 1. Regeneración in Vitro

Autores (p.o. de firma): Robaina RR, García-Jiménez P, Luque A Título: The growth pattern and structure of callus from the red alga Laurencia sp (Rhodophyta, Ceramiales) compared to shoot regeneration Ref. Clave: A 1992

revista: Botanica Marina Volumen: 35

Libro Páginas, inicial: 267

final: 272

Fecha:

Capítulo 2. Asepsia

51

Table 2. Chemicals used as sterilizant in seaweed tissue culture. Sterilization procedures start at primary treatment using a primary chemical disinfectant of broad spectrum and a surfactant to increase it effectiveness. It follows with incubation in a mixture of different antibiotic solutions to face with bacterial, fungi and diatoms associated epiphytic biota. Concentrations used are widely variable among authors as it is suggested to adjust it species specifically.

Treatment

Effect

Primary

Surfactant

Incubation time

Triton X – 100, Agryrol, Linbro R 7x

References

Gibor & Izawa, 1963; Chen, 1986, 1989.

General antiseptic Alcohol, Chlorohexidine digluconate

Saga & Sakai, 1983; Gusev et al., 1987.

Oxidizing agents Ca (OCl)2, NaOCl, H2O2, KI - I2, Commercial

Fries, 1963; Druehl & Hsiao, 1969; Fries, 1980;

iodine solutions (i.e. Betadine or Jodopax)

Polne-Fuller et al., 1980; Gibor et al., 1981;; Reddy et al., 1989.

Secondary

60

incubations Bactericidal Streptomycin, Kanamycin, Gentamicin,

Days ( 2 to 7)

Chen &Taylor,1978; Polne - Fuller & Gibor,

Neomycin, Penicillin, Ampicillin,

1984; Fisher & Gibor, 1987; Xu – Wu &

Ciproflaxicin

Gordon, 1987; Kajiwara et al., 1988; Kloareg et al., 1989; Kawashima & Tokuda, 1990Robaina et al., 1990; Yokoya et al., 1993; Chen & Chiang, 1994; Yokoya & Handro, 1996; Yokoya et al., 1999; Yokoya, 2000; Russig & Cosson, 2001; Reddy et al., 2003.

Carbenicillin, Polymixin B, Rifampicin,

Hours (5 to 48)

Chloramphenicol

Druehl & Hsiao, 1969; Saga & Sakai, 1982; Cheney et al., 1986; Butler et al., 1989; Yokoya et al., 1999; Russig & Cosson, 2001.

Fungicidal

61

Nystatin

Days (2 to 7) in

Polne - Fuller & Gibor, 1984, 1987; Fisher &

the same solution

Gibor, 1987; Tokuda & Kawashima, 1988;

of bactericidal

Kloareg et al., 1989; Robaina et al., 1990 a, b, 1992; Chen & Chiang, 1994; García-Jiménez et al., 1996, 1998, 1999; Yokoya & Handro, 1996; Yokoya et al., 1999; Yokoya, 2000; Reddy et al., 2003.

Against diatoms Germanium dioxide

Days (2 to 7) in

Lewin, 1966; Gall et al., 1990; García-Jiménez

the same solution

et al., 1996, 1998, 1999; Robaina et al., 1990 a,

of bactericidal

b, 1992; Marián et al., 2000 b; GuzmánUrióstegui et al., 2002; b; Sacramento et al., 2004.

62

Capítulo 3. Control del crecimiento y desarrollo

Table 3. Examples of the effects of PGR´s on in vitro culture of seaweeds, listed chronologically by reference. BA, benzyladenine; 2-4 D, 2-4 dichlorophenoxyacetic; 2,4,5-T, 2,4,5 trichlorophenoxyacetic; GA3, gibberellic acid; IAA, indole-3-acetic acid; iP, isopentenyladenine; Kin, Kinetin; NAA, naphthalenacetic acid; PAA, phenoxyacetic acid; PUT, putrescine; SPD, spermidine; SPM, spermine

Reference

PGR

Species

Stimulating effect observed as

Provasoli, 1957

Kin , IAA

Ulva lactuta

Filamentous growth

Jennings, 1969

Kin

Ecklonia e Hyphea

Growth

Dawes, 1971

IAA

Caulerpa prolifera

Growth

Pedersen, 1968

Kin

Ectocarpus fasciculatus Dilophus fasciola Stypocaulon scoparium Ceramium ciliatum Porphyra leucosticta

Morphogenesis from rhizoids Growth Growth Delayed senescence Delayed senescence

Augier, 1976 Kin

Fries & Iwasaki, 1976

PAA, OH-PAA

Porphyra tenera

Growth

Fries, 1977

Fucus spiralis

Growth and morphogenesis (ramification)

Dworetzky et al., 1980

OH-PAA and PAA Kin or GA3 + Kin

Sphacelaria furcigera

Growth and cell division

Mooney, 1983

Kin

Sargassum heterophyllum

Growth and cell division

Zhang, 1982

NAA

Undaria pinnatifida

Callus induction

Fries, 1984

IAA, PAA, OHPAA

Fucus spiralis

Growth and morphogenesis (plantlet formation)

63

Gusev et al., 1987

Kin

Gracilaria verrucosa y Furcellaria fastigiata

Callus induction

Fries, 1988

IAA, iP, Zeatine

Ascophyllum nodosum

Growth

Bradley & Cheney, 1990

PAA, Zeatin, BA, NAA, IAA, 2,4,5-T

Agardhiella subulata

Cell division and growth

Nys et al., 1991

Zeatin, iP

Macrocystis pyrifera

Growth

Liu & Kloareg, 1991

NAA, Kin

Porphyra umbilicalis

Callus induction

Kaczyna & Megnet, 1993

IAA, IPA, iP

Gracilaria verrucosa

Cell division

Amano & Noda, 1994

Zeatin

Ulva Pertusa

Growth

García-Jiménez et al., 1998

Kin, 2-4, D, PUT, SPD, SPM

Grateloupia doryhora (sporelings)

Callus formation, regeneration of new axes

Yokoya et al., 1999

IAA, 2,4-D, BA

Gracilaria vermiculophylla

Callus induction

Hemalatha & Rengansamy, 1999

Kin

Gracilaria edulis

Growth

Joseph & Chennubhotla, 1999

GA, 2-4-D

Gracilaria coricata, Hypnea valentiae, Ulva fasciata

Growth

Marián et al., 2000 b

PUT, SPD, SPM

Grateloupia doryphora (sporelings)

Cell mass formation in glycerol medium

Guzmán-Urióstegui et al., 2002

PUT, SPD, SPM

Gracilaria cornea

sporulation

Yokoya & Handro 2002

IAA, 2,4-D, BA

Solieria filiformis

Growth and regeneration

Hurtado & Cheney, 2003

NAA, NAA +BA

Eucheuma denticulatum

Callus induction

64

Sacramento et al., 2004

PUT, SPD, SPM

Grateloupia sp

sporulation

Yokoya et al.. 2004

IAA, 2,4-D

Gracilaria tenuistipitata

Callus induction

65

Capítulo 4. Poliaminas

putrescina (put, NH2-(CH2)4-NH2), espermidina (spd, NH2-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH2) espermina (spm, NH2-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3NH2)

Capítulo 5. Cymodocea

PANAMA

Index: Introduction: Chapter 1. SEAWEED RESOURCES OF PANAMA Gloria Batista de Vega , Carmen Berguido & Dalys E. Alveo.

Chapter 2. SPECIES OF MACROALGAE ON GALETA POINT AT CORAL REEF SITE 16 YEARS AFTER THE OIL SPILL IN 1986. PROVINCE OF COLON, REPUBLIC OF PANAMA, 2004. Denis Gomez; Haidy Perez and Gloria Batista de Vega.

Chapter 3. USE OF THE SEAWEEDS RESOURCES ON THE CARIBBEAN COASTLINE, PROVINCE OF COLON, PANAMA AND ITS POTENTIAL ECONOMIC POSIBILITIES Gloria Batista de Vega and Raul Yee.

Chapter 4. FOOD AND MEDICAL USES OF MARINE ALGAE BY KUNA INDIANS ON THE CARIBBEAN, PANAMA Gloria Batista de Vega and Dalys E. Alveo.

Chapter 5. SEAWEED FARMS ON THE CARIBBEAN COAST OF PANAMA Gloria Batista de Vega, Chris Shields, Raul Yee and José González.

Acknowledgements Messages from leaders of the Republic of Panama compromised with the well being of the coastal zone

INTRODUCTION Although research work about seaweed of Panama started in 1910 with Marshall Howe, the results are historically hard to follow due perhaps to the lack of detailed ways to identify the list of specimen on file and poorly documented to date. These publications suffer a total absence of the works published in Spanish such as many thesis of the University of Panama and other investigators of the area. A brief resume of all Seaweed resources of Panama is presented in this study as part of the project entitled “Seaweed Resources of the World.” We hope to contribute with interesting findings about how far Panama has advanced in the seaweed resources and how much is still to be done. Chapter 1 starts with the localization of the territory of Panama and its importance as a maritime zone of transit. There is a general description of the coastline of the Pacific and the Caribbean. It follows with a description in detail of the Caribbean shoreline, its marine environment conditions and its mangroves forests, coral reefs and marine prairies ecosystems. The physical structure of the central Caribbean coast of Panama and its biological communities are described within its complexity. Chapter 2 give us the opportunity to present Galeta Marine Laboratory located just at the center of the Caribbean Sea of Panama as a unique site that has been collecting environmental data since the early 1900’s and biological data of a coastal community since 1968 until now. The coastline of Galeta offers considerable studies of the biocommunity that allows scientists to make comparisons before and after environmental impacts. This chapter presents an example of species of macroalgae found 16 years after an oil spill occurred in a specific site intensively studied before and after the impact. In spite of the intensive and well documented Ethno botanical investigations on the use of plants in Panama, it has been largely ignored the use of marine plants. Chapter 3 and Chapter 4 show that at least two ethnic groups collect and consume seaweeds: Afro-Antillean of West Indian descent and Kuna Indians. Chapter 5 introduces us to the activities with macroalgae with the native people. The cultivation of algae is based in the principle that the algae are part of ethnic culture. A carefully managed cultivation of the environment and intelligent harvesting resulted in a co-operation of all the parties located on the coastline. Their compromise is giving benefit to the natives and to modern industries. We close this Chapter with the messages of the most important leaders of the country of Panama who work every day in the coastline and are responsible to make significant differences of Panama as a unique coast to show to the world.

1

SEAWEED RESOURCES OF PANAMA Chapter 1 GLORIA BATISTA DE VEGA 1, CARMEN BERGUIDO 2 & DALYS ALVEO 3. 1

- University of Panama, Vice-President of Extension and ChevronTexaco Company. - Panamanian Association of University Women (AMUP) and Fundación Amistad. 3 - University of Panama, Estafeta Universitaria, Panamá. Ciudad universitaria Octavio Méndez Pereira. Web: www.up.ac.pa/ 2

E-mail: [email protected] Panama is the narrowest isthmus in the center of the America Continent located between (7°12´07” and 9°38
46” Latitude North and 77°09
24" and 83°03
27” Longitude West). The narrowest part is 82 km between the two oceans: the Caribbean and the Pacific with a considerable longitude of coast: 2,988 km in total, with 1,500 islands, keys and small islets.

The territory of Panama came to be, with the Chagres River, a very important zone of transit since the XVI Century. The Chagres River was, for more than 200 years, the most important route of communication between the two oceans. Through its waters transported the wealth of the nations in precious metals, jewels, commodities and manufactured goods. Later, during the California Gold Rush, the first Railroad was built in Panama and the importance of the Isthmus was greater. In the XX Century, with the construction of the Panama Canal, Panama became the most important route of marine transportation in the world and, due to the system of locks; the Chagres River

2 recovered its fame and is now the only river in the world that empties in two oceans. The Pacific Ocean with a coastline of 1,700.6 km long and the Caribbean Sea with 1,287.7 km. DESCRIPTION OF THE COASTLINES In both coasts of the Isthmus of Panama there are modern coral reefs, well developed and with ages between 3,000 to 7,000 years (Macintyre & Glynn, 1976; Glynn & Macintyre, 1977). The coral reef communities in both oceans are different in account of its distribution, size, abundance and composition of the species (Glynn 1972, 1982; Porter 1972, 1974). Besides, the physical factors (i.e., closeness to the continent, temperature of water, sedimentation) that affect and also limit the growing and development of the reef are very particular in both coasts (Porter 1974, Glynn 1983). The climatic regime, according to the seasons, is relatively similar in all the country of Panama, but the coral reefs in both sides of the Isthmus are influenced by very pronounced climatic changes. The Caribbean is affected mainly by rain falls, high sedimentation, and strong winds; while the Pacific side is affected by low temperatures during the period of outcropping (Glynn 1972, 1982, Cubit et al. 1989). In this study we are going to refer only to the Caribbean Coast of Panama, where the research work presented here has been done. THE MARINE ENVIROMENTAL ON THE CARIBBEAN COAST OF PANAMA Panama on the Caribbean Sea, has a coastline of 1,287.7 km from Obaldia Port in the East to Changuinola in the West. This is a very low populated area. The province of Colon has the largest population 174,059 inhabitants according to the census of the years 2,000. The region has a succession of narrow beaches to the West and an extensive zone of coral reefs and mangrove to the East. The shoreline shows the proximity of mountains to the sea and a diversity of environments including mangroves and beaches of sands, rocks and mud; also marine prairies and coral reefs about 750 km of reefs distributed along the coast. Panama is located South of the hurricanes zone, so it is not affected directly by them. Strong Alisios Winds influence the coast during the dry season (December to April). Superficial waters circulate west to east with relative constant temperatures (27°C) during the year. The sea tides are of the small size (0.5 m) irregular, during the day and influenced by atmospheric conditions. Pluviosity is high, in some localities up to 7,000 mm by year. The continental platform is narrow 5 to 35 km rarely more than 25 km. The San Blas Islands, to the east, are more than 300 coral islands extended 200 km from Colombia to San Blas Gulf. Along the shoreline are muddy areas, coral reefs and mangrove in a narrow zone. To the west there is a succession of narrow beaches, separated by cliffs. In the Gulf of Mosquitos the coast is regular and highly exposed to marine conditions. The Bocas del Toro Islands are near the limit with

3 Costa Rica. There are about 50 keys. On the seashore, mainly mangrove trees, marine prairies and coral reefs. The Chiriqui Lagoon, approximately 840 km2 is one of the most extensive lagoons in the Caribbean coast and the largest in Panama. The rivers born 50 km south in the Central Mountains run to the Caribbean through coastal prairies important economically to the region. The most important rivers on the Caribbean side are: Chagres River (125km), Changuinola River (118 km), Indio River (97km), Cricamola River (83 km). Oceanic conditions influence greatly the coastal area of the Caribbean seashore. In relative terms the Caribbean seems to be more stable and allows the development of species such as corals that cannot resist sudden changes in salinity, temperature or long periods of exposition. The coral reefs of the Central coastline of the Caribbean of Panama are characterized by its way of forming barriers parallel to the coast, others are widely distributed along the coast and they develop up to 10 m or 15 m depth (Guzman et al. 1991). Historically, the coral reefs situated in the northern entrance of the Panama Canal (Caribe) and its surroundings have been affected by diverse anthropogenic activities. During the Spanish conquest and colonization, five centuries ago, the coral reefs of Limon Bay and Las Minas Bay were exploited for the construction of the Portobelo Forts. Since 1982, exploitation continued with the construction of the Panama Canal and Cristobal Port. Then, we begin to observe the major destruction of coral reefs in the area due to the construction of the Panama Canal. Between 1910 and 1916, two breakwaters were constructed in the entrance of Limon Bay in an extension of 3.3 km. From 1915 to 1928 and during the years of war 1942 to 1944, Margarita Islands, Cocosolo, Largo Remo and Galeta were transformed in peninsulas. Hundred of hectares of mangrove trees were destroyed to the filled with coral and converted into landing fields and barracks as part of military installations of the zone (Copeland 1964). More recently, between 1958 and 1986, more than 5 millions of m
of coral from the coral reefs in Payardi and Largo Remo islands were dragged for the construction of Panama Refinery (Guzmán & Holst, 1994). In the Caribbean area specially the ecosystems of mangroves, marine prairies and coral reefs develop through a gradient from the land to the sea and they show a high interdependence between them. These interactions could be observed on the reef ecosystems. It gives sand to the tropical beaches; at the same time gives protection to mangrove and marine prairies during tropical storms dissipating energy in an efficient way (Richmon, 1993). At the same time, the mangrove trees protect the coral reefs of sedimentation and eurotrophication of waters and together with the sea grass beds offer areas for eggs planting and living areas for species associated to coral, such as algae, and even to species of the ocean (Jameson et al 1995). The marine sea grass functions as stabilizers of sediments because they avoid its deposition in the sensitive coral reefs (Ogden and Cladfefter 1983).

4 PHYSICAL STRUCTURE OF THE CENTRAL CARIBBEAN COAST OF PANAMA AND ITS BIOLOGICAL COMMUNITIES There are several published studies of 1986 that describe in details the physical structure of the Central Caribbean Coast of Panama. They described the largest complex of mangroves and coral reefs on the mentioned area. It consists primarily of fringing reefs with extensive, periodically drying (intertidal) reef flats (Macintyre and Glynn, 1976). Going from seaward to landward, the reefs begin with a fore reef slope of hard substrata covered predominantly by algae, and secondarily by corals and other sessile invertebrates. Where the fore reef slope rises into the intertidal zones, is becomes part of the reef flat. Most reef flats on this coast have a raised outer crest of hard carbonate pavement deposited by crustose coralline algae. Landward of the reef crest is a mixture of coral bench, loose coral rubble, and loose sediments. Sediments usually become progressively finer toward the back reef. Seagrasses (mostly Thalassia testudinun) and rhizophytic green algae (mostly Penicillus capitatus and Halimeda sp.) grow in loose sediments of this interior portion of the reef flat, and various other algae grow epiphytically on seagrasses and attached to hard substrata of the exposed coral bench and coral rubble. Most of these sediments are produced by calcareous algae and invertebrates and sediments are accumulated and held together by seagrasses, rhizophytic algae, and mats of attached algae. Beaches of sand often form on back-reef flats. Mangroves, mostly the red mangrove Rhizophora mangle, colonize intertidal levels of these elevated areas sand deposits forming the seaward fringe of mangrove forest. On these elevated areas of sand, forest of other woody and herbaceous plants, including coconut palm (Cocos nucifera) and sea grape (Cocolobo sp.), grow just above the level of mean high tide. In intertidal areas behind beaches, mangroves continue landward and cover intertidal substrata. Mangroves line the margins of freshwater streams where these streams enter the range of the tides (Cubit & Levings, 1990). PATTERNS OF WEATHER AND SEA CONDITIONS ON THE CARIBBEAN COAST OF PANAMA According with John Cubit and collaborators, 1989, the annual pattern of weather in this region of Panama is locally described as having a “dry season”, a variable “little dry season”, and a “rainy season”. This pattern was persistent through 20 years of records. The range of monthly mean water levels is approximately 20 cm, and the seasonal amplitude of mean water levels averaged approximately 9 cm; for relative scale, the mean diurnal tidal range of the tides on this coast on 30 cm. The rainy-dry season alternation is common in the low latitude tropics and caused by north-south migrations of the trade wind belts and the Intertropical Convergence Zone (Glynn 1972; Riehl 1979). However, the relative lengths of the seasons and the within season variation of climatic factors changes over relatively small distances (Riehl 1979). The Caribbean coast of Panama shows an averaged yearly accumulated rain column of 2,559 mm (Contreras and Rosenthal, 2003).

5 WATER LEVELS Mean over the reef flat tended to be higher than those in deeper water, a result of wind-generated waves piling up water on the reef flat (Cubit et al. 1986). The wave effects accounted for much of the seasonal pattern of water level and its similarity to the seasonal pattern of onshore wind. Wind stress, barometric pressure, and seasonal oscillation of mean sea level had less effect on water level (Cubit et al. 1986). Fluctuating water level was probably the single most important physical factor causing changes in the distribution and abundance of the biota on the reef flat at Punta Galeta, mainly by affecting the frequency and duration of emersions of the reef flat during low tides (Cubit et al. 1985, 1986). WATER TEMPERATURE Extremes of water temperature were clearly dependent on water depth over the reef flat. They ranged from 22 to 37.9 °C in shallow water, but remained between 25 to 30.9 °C in water only 30 cm deeper (Cubit et al. 1989). COMPARISON OF WIND DIRECTION, WATER TEMPERATURE, PRECIPITATION AND SALINITY USING MONTHLY SPLINE FITS Contreras and Rosenthal, 2002 analysed the yearly average spline fits of each of its parameter. They compared with the objective to find temporal relations between them. They found the following conclusions: (Figure 1.)

6 When the winds come from the North the temperature decreases. Its occurs mainly in the winter season. This is probably related to a lent mixing process on the top layer of water due to the sea wave state. The salinity in this period increases. 1) When the winds come from South bring mainly wet air masses. The precipitation rate increases and salinity decreases whereas water temperature remains and is not affected by these changes. 2) BOUY MEASUREMENTS ON THE CENTRAL CARIBBEAN COAST Since October 18, 1999 the Coastal Research Institute of GKSS, research centre, one of the fifteen national facilities that make up the Hermann von Helmholtz Society of German Research Centers (HGF), installed a high tech monitoring system to integrate environmental data at the site (Photo 1. File JPEG, Seaweed Resources of Panama). The Buoy is gauging different oceanographic parameters a real time from the sea state conditions as well as physical characteristics of the water showed at htpp: //meteo.GKSS.de/ then click Panama-Colon-Caribbean 1 (Buoy)

Photo 1

7 The datasets were analysed in order to find average of each weekday, that means e.g. comparing Fridays and Mondays information. The results of this analysis are shown on the Figure 2 (File JPEG, Seaweed Resources of Panama). It shows that on Sunday the water temperature is lower than the other weekdays for 0.06°C in average.

8

Contreras and Rosenthal, 2002 showed in Figure 3 (File JPEG, Seaweed Resources of Panama), the gauged water temperature since Feb. 01. 2002 to Mar. 31. 2002, in the same graphic are presented the water tide levels on the same time period. There can be assumed a relationship between lower tide levels and highest water temperature. Due to this, the hypothesis was established that low tide levels cause less water exchange in the Bay, then the thermo plume has great influence on the coastal region. Parallel to that Buoy Data Analysis, satellite images with information (Photo 2. File JPEG, Seaweed Resources of Panama) with Sea Surfer Temperature SST were used to compare the results. The AVHRR (Advance Very High Resolution Radiometer) device of the NOAA provides the time period of every 22 hours. The GKSS was recovering images in the time period between 09. Feb. 2002 07:40 UTM till 28 March 2002 00:14 UTM. Once the information was processed, from the 56 recovered images only 36 were useful, mainly due to the dense clouds coverage typical of that planet region mainly after midday.

9

Photo 2

SEAWEED OF PANAMA The first reports about seaweeds in Panama started from Marshall A. Howe 1910. Numerous investigators have made reports about existing species. Benthic algae are found up to limit of 200 m depth, but their greater development occur to 30 m (Earle, 1972). The record of phycological study in Panama started in 1919 with the observations on coralline algae by Marshall A. Howe of the New York Botanical Garden. Taylor (1929, 1939, 1941, 1942, 1955 and 1960) provided information on species along Panama’s Caribbean coast in the provinces of Bocas del Toro, Colon and San Blas. Studies made in the coral reefs of Galeta Point on the Caribbean coast of Panama by Cubit, et al. (1986) listed 150 species of macroscopic algae in this area. Studies of species of the Caribbean Sea have largely ignored studies published in Spanish. A number of thesis from the University of Panama have focused on marine algae, including a study of phycocolloids in some red algae on the Atlantic Coast of Panama by Linares R. and Solis (1965). Their study indicated that Panama could potentially develop new industries based on its marine resources. In 1975, Batista de Yee and Chang reported on the density and caloric value of 25 species of algae associated

10 with beds of the turtlegrass, Thalassia testudinum. Villamil (1975) completed a thesis “Comparative study of two methods used to extract lipids from Algae”, a study of Halimeda and Chara. Mendoza collected and published an inventory of the algae flora in the coast line of the province of Colon in Galeta Point, Maria Chiquita and Playa Langosta. Later in the 1980s, Batista and student helpers interviewed inhabitants between Bocas del Toro and San Blas to learn of the use of algae by ethnic population along the Caribbean coast of Panama. They also investigated algae sold in local markets and algae imported by local industries. Cubit and collaborators (1984) described some uses of the marine algae by the Panamanians of Afro-Antillean descent. The Afro-Antillean groups used two species of red algae, Gracilaria crassissima and Gracilaria mamillaris, to make aphrodisiac drinks and to prepare soups. In addition, Sargassum is used as medicine. In a thesis study of the Archipielago de las Mulatas, San Blas in Kuna Yala (Palacios, 1989) classified the distribution of Chlorophyta in relation to the sustrata and provided ecological observations of the areas. Few studies have been reported on the quantity or quality of seaweeds extracts from Panama. Some analysis about the presence of agar-agar in the life history of Gracilaria sp used by the ethnic groups of the Republic of Panama were studied by Gloria Batista in 1984. The female, tetraspore and sterile phase were extracted and they were verified in 1999 by the Specialized Institute of Analysis of the University of Panama. All of the phases showed an infrared spectrum of the agar-agar that marked at strong presence of the agar in all of the phases of the specie studied. The specie also showed a clear variation between the phases of life specially in the proteins zones (1650-1550). These differences probably are caused by the effect of seasonal weather changes when the samples were collected (Unpublished information). Gupta and collaborators (1991) estimated the percentage of agar-agar in seven genders of macro-algae from the Caribbean coast with the object to identify its antimicrobial action. Caulerpa racemosa, Halimeda opuntia, Gelidiella acerosa, Laurencia papillosa y Acanthophora spicifera, showed antimicrobial activity against Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis in a concentration of 50mg/ml by the cylinder plate method. Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus niger and Candida albicans. The content of agar in Acanthophora spicifera was found to be the highest (33.5%) of all the species studied. In 1986, Batista and Connor published the use of several species of marine algae by two ethnic groups in the Caribbean coast. The Kuna group uses 37 species and other 7 species are used by the Afro-Antillean. 14 illnesses described by the Inaduledi are treated with these algae. In 1992, Gloria Batista described in detail the use given to each specie by these ethnic groups. These species were identified by Taxonomic process by Judy Connor and the Kuna names were given by the Inaduledi. (See Chapter 4) The Afro-Antillean groups used mainly two species of red algae, Gracilaria crassissima and Gracilaria mamillaris, to make aphrodisiac drinks and to prepare soups. The Sargassum is used as medicine (Cubit et all, 1984), (see Chapter 3).

11 Studies made in the coral reefs of Galeta Point from 1981 to 1984 by Dr. Connor reported 113 species of marine algae and 39 genders, many of them had never been reported in this area. In 1986, 150 species of macroscopic algae were listed in this area by Cubit and collaborators. Escobar and Fuentes (1993) completed their thesis “Determination of the seasonal variation of some ecological properties and quantity of agar-agar in the species Acanthophora specifera (Val) Borgesen and Bryothamnion triquetum (Gmelin) Howe”. They confirmed the presence of agar-agar in these species, and compared the content of agar-agar (g dry weight), the quality of agar extracted, measuring properties as consistency. They found that the quality of agar extracted in Acanthophora specifera does not show a significant season variations. The values were between 43% to 50%. These are greater than the values reported by Gupta et al 1991. Bryothamion triquetrum values of agar were no detectable. Garibaldi (1998) listed 118 Macro-algae species reported in the Caribbean area. Averza and collaborators (2000, 2002) listed 175 species of seaweeds belonging to 19 orders, 42 families and 95 genders from the Caribbean side of Panama, comparing species richness with that reported in Costa Rica and Colombia. Soler and collaborators (2003) are studying the benthic species of micro-flora in the platform of coral reefs in Galeta Point, and so far have published 314 taxa that probably characterize the population of benthic species of the micro-flora on the northern entrance of the Panama Canal. Brian Wysor in 2002 collected macroalgae along the Caribbean coast of Panama, resulting in the curation of 957 specimens. He published 277 of Chlorophyta including 35 species of 10 rareties, forms or subspecies never before recorded for the Republic of Panama. The study included the site, previous references, morphology and ecological distribution for each specie. In 2003, B. Wysor and O. De Clerck annotated 36 Taxa of Phaeophyta including 16 new records. Most of the species diversity is restricted to two families, Dictyotaceae and Sargassaceae. MARINE PRAIRIES OR SEA GRASS BEDS On the Caribbean side, species of marine prairies Sea grass Beds present a wide development specially in shallow waters on the seashore where species Thalassia testudinum and Halodule wrightii have been reported. To a profundity of about 10m were found the species Syvingodium filiforme and Halophila baillonis (Earle, 1972).

12 CULTIVATION OF SEAWEED IN PANAMA A feasibility study of Gracilaria sp. Seaweed Farms on the Caribbean Coast of Panama started with Gloria Batista in 1988 with a great help of Arnold Schultz and Wayne Sousa, Professors of the University of California, Berkeley. This project was in connection with the establishment of a nature reserve with an economic purpose; on a very sensitive coral reefs and mangrove ecosystems that came under Panamanian management in the year 2000 due to the 1977 CarterTorrijos Treaty. The study included the seeds and knowledge from the native people that use the species. Since 1992, an experimental seaweed farms study was integrated with the management plans of the area by Gracilarias de Panama S.A., a small enterprise part of the Technology Park of the City of Knowledge with the collaboration of Smithsonian Tropical Research Institute, The University of California in Berkeley, the University of Panama, ChevronTexaco Company and the local people of the area (Batista et al. 2002). A first Kappaphycus Alvarezii seaweed farm was established on the Caribbean Coast of the Republic of Panama in 2000 with seedling branches brought by native people on the area (Batista et al. to be published at ISS, 2004). This project is part of an experimental seaweed farm on the Caribbean coast of Panama, a three phases project from 1999 to 2001 (Panama Maritime Authority: PEC: 360-98; Batista de Vega et al. 2002). ACKNOWLEDGEMENT The authors would like to thank the SeaWiFS Project (Code 970.2) and the Distributed Active Archive Center (Code 970.2) at the Goddard Space Flight Center, Greenbelt, MD. 20771, for the production and distribution of these data, respectively. These activities are sponsored by NASA´s "Mission to Planet Earth Program". The authors give special thanks for the technical and logistic support offered to the project by Dr. Hans Von Storch (Director of Coastal Research GKSS); Dr. Wolfgang Rosenthal (Head of Department of Combined Models GKSS) and Adolfo Contreras (Ph D. student) for their invaluable help in this research work. The authors would like to thank the Coast Watch Caribbean Regional Node NOAA/OML Remote Sensing Group, for the production and distribution the AVHRR (Advance Very High Resolution Radiometer) data.

13 REFERENCES •

Batista, G. and Connor J. December 1990. Native Uses of Seaweeds in the Republic of Panama. Annotated Bibliography of the Seaweeds used for food in the West Indies. OECS Fisheries Report No3.7-8. Caribbean Natural Resource Institute (CANARI) St. Lucia (Eds).

•

Batista, G. 1992. Gracilaria sp. Sea Farm on the Atlantic Coast of Panama in Connection with Establishment of a Nature Reserve with and Economic Purpose. MS thesis, Forestry Department, University of California, Berkeley.

•

Batista de Vega, G.; Contreras A.; Shields C. Septiembre 2002. Granjas Experimentales de Gracilaria sp y Eucheuma cotoni en el Caribe Panameño. VI Congreso Latinoamericano de Ficología y IV Reunión Iberoamericana de Ficología; Ponce, Puerto Rico. Pág. O 26. Sociedad de Ficología Latinoamericana y del Caribe y Pontificia Universidad Católica de Puerto Rico (Eds). Batista de Vega, G.; Contreras A.; Shields C; González, J. Septiembre 2002. Granjas Experimentales de Gracilaria sp y Eucheuma alvarezii en el Caribe Panameño. “Sociedad y Universidad”, I Congreso Nacional de Extensión Universitaria. Vicerrectoría de Extensión, Universidad de Panamá, Panamá (Eds).

•

•

Batista Vega, G.; Trespoey, A.; Critchley, AT.; Bleicher Lhonneur, G.; Shields, C. and Lao, S. 2004. Cultivation of Red Algae Near the Caribbean Entrance of the Panama Canal and Optimization of Carrageenan Quality. To be published at XVIII International Seaweeds Symposium, Norway.

•

Connor, J. 1984. Seasonal Changes in an Algal Community of the Tropical Fringing Reef in Panama. Submitted in partial satisfaction of the requirements for the degree of Doctor in Philosophy in Botany, University of California, Berkely.

•

Contreras A. and Rosenthal W. 2003. “Data analysis of the water temperature on Bahia Las Minas, Panama. The Integrated Caribbean Coast Monitoring Project Panama (Internal Document 1-19, Coastal Research Institute, GKSS). Copeland, E. 1964. Coco Solo once vital base now weed choked symbol. Periódico Panamá América, 5 de Julio.

• •

Cubit, J.; G. Batista; A. Román y V. Batista. 1985. El valor de los manglares y arrecifes en la costa de Colón. Agonía de la Naturaleza. Ensayo sobre el costo ambiental del desarrollo panameño. Heckadon Moreno Stanley y Espinosa González, Jaime.183-199.

•

Cubit, J.; Thompson, R.; Caffey, H. M. and Windsor, D. M. 1986. Hydrographic and meteorological studies of a Caribbean fringing reef at Punta Galeta, Panama: Hourly and Daily variations for 1977-1985. Smithsonian Contributions to the Marine science.

•

Cubit, J. D., Caffey, H. M., Thompson, R. C. & Windsor, D. M. 1989. Meteorology and Hydrography of a shoaling reef flat on the Caribbean coast of Panama. Coral Reefs 8: 59-66.

14 •

Cubit, J. & Levings, S. 1990. Weather, Sea Conditions, and Topography Affecting Oil Deposition during the 1986 Bahia Las Minas Oil Spill.

•

Earle, S.A. 1972. A review of the marine plants of Panama. Bull. Biol. Soc. Wash. 1972: 69-87.

•

Escobar, C. y J. Fuentes. 1993. Determinar la valoración estacional de las algas propiedades reológicas y del contenido de agar-agar en las especies Acanthophora spicifera (Vahl) Borgesen y Bryothamnion triquetrum (Gmelin) Howe. Tesis de Licenciatura. Panamá. Universidad de Panamá.

•

Garibaldi, Cristina. 1998. Informe Nacional sobre la Diversidad de Plantas en Panamá. Instituto Nacional De Recursos Naturales Renovables, Panamá.

•

Glynn, P. W. 1972. Observations on the Ecology of the Caribbean and Pacific coasts of Panama. Bull. Biol. Soc. Wash. 2 : 13-30. Glynn. P. W. & Macintyre, I. G. 1977. Growth rate and age of coral reefs on the Pacific coast of Panama. Proc. Inter. Coral Reefs Symp. 2: 251-259. Glynn, P. W. 1982. Coral Communities and their modifications relative to past and prospective Central American seaway. Adv. Mar. Biol. 19 : 91-132. Glynn P. W. 1983. Extensive “bleaching” and death of reef corals on the Pacific coast of Panama. Environ. Conserv. 11 : 133-146. Guzman, H. M., Jackson, J. B.C & Weil, E. 1991. Contamination of reef corals by heavy metals along the Caribbean Coast of Central America (Costa Rica and Panama). Mar. Pollut. Bull. 24: 554-561. Guzmán, H. y Holst, I. 1994. Arrecifes de coral y comunidades coralinas. Scientia (Panama), Vol. 8 No 2, 60-79. Jameson, S.C.; J.W. McManus y M.D. Spalding. 5. state of the Reefs: Regional and Global Perspectives. International Coral Reef. Initiative Executive Secretarial Background Paper, US Department of State. Washington DC, 32pp. Linares, L. and Solis R. 1965-1966. Ficocoloides de algunas Algas Rojas de la Costa Atlántica de la Costa de Panamá. Tesis de Licenciatura. Universidad de Panamá, Panamá. Macintyre, I. & Glynn, P. W. 1976. Evolution of modern Caribbean fringing reefs, Galeta Point, Panama. Am. Ass. Petrol. Geo. Bull. 60: 1054-1071. Palacios, G. 1989. Clasificación y Distribución de las Algas Clorófitas (Chlorophyta) Macroscópicas del Archipiélago de las Mulatas, San Blas (Kuna Yala). Tesis de Licenciatura, Universidad de Panamá, Panamá. Porter, J. W. 1972. Ecology and Diversity of Coral Reefs on Opposite Sides of the Isthmus of Panama. Bull. Boil. Soc. Wash. 2: 89-116. Porter, J. W. 1974. Community Structure o Coral Reefs on Opposite Sides of the Isthmus of Panama. Science 186: 543-545. Richmon R. H. 1993. Coral Reefs: Present problems and future concerns resulting from anthropogenic disturbance. Amer Zool. 33:524-526. Riehl, H. 1979. Climate and Weather in the tropics. Academic Press, London New York, San Francisco.

• • • • • •

• • • • • • • •

Soler, A.; Aguilar, E. y Pérez, M. 2003. Diatomeas Perifíticas observadas con mayor frecuencia en Galeta, Costa Atlántica de Panamá. Centro de Ciencias

15 del Mar y Limnología y Departamento de Botánica, Universidad de Panamá, Panamá. • • • • • • • • •

Taylor, W. R. 1929. Notes on Algae from the Tropical Atlantic Ocean (1). Amer. J. Bot. 16: 621-630. Taylor, W. R. 1941. Topical Marine Algae of the Arthur Schott Herbarium. Fiel Mus. Nat. Hist., Publ. 509, Bot. Ser. 20(4): 87-104. Taylor, W. R. 1942. Caribbean Marine Algae of the Allan Hancock Expedition, 1939. Rep. Allan Hancock Atlantic Expe. (2): 1-193. Taylor, W. R. 1955. Marine Algal Flora of the Caribbean and its Extension into neighboring seas, pp. 259-278, IN: Essays in the Natural Science in Honor of Capitan Allan Hancock, Univ. of So. Calif. Press, Los Angeles, 345. Taylor, W. R. 1960. Marine Algae of the Eastern Tropical and Subtropical Coast of the Americas, Univ. of Michigan Press, Ann Arbor, 870 p. Villamil, Rodrigo. 1975. Estudio comparativo de dos métodos de extracción de los lípidos en algas. Tesis de Licenciatura. Panamá. Universidad de Panamá. Windsor DM (in press) Climate and moisture variability in a Tropical Forest: Long-term records from Barro Colorado Island, Panama. Smithson Contr Earth Sci. Wysor, B. 2002. Biodiversity and Biogeography of Marine Green Algae of the Republic of Panama. University of Louisiana at Lafayette. Wysor, B. and De Clerck, O. 2003. An Updated and Annotated List of Marine Brown Algae (Phaeophyceae) of the Caribbean coast of the Republic of Panama. Botanica Marina Vol. 46, pp. 151-160.

16

Acanthophora spicifera

Amphiroa tribulus

Acetabularia calyculus

Anadyomene stellata

Amphiroa rigida

Avrainvillea elliottii

17

Bryopsis pennata

Caulerpa cupressoides

Caulerpa racemosa

Caulerpa sertularoides

Chondria littoralis

Codium isthmocladum

18

Dictyoptheris delicatula Enteromorpha flexuosa

Dictyosphaeria cavernosa

Galaxaura oblongata

Dictyota divaricata Gelidiela acerosa

19

Gelidium pusillum

Gracilaria mammillaris

Halimeda discoidea

Gracilaria cervicornis

Halimeda incrassata

Gracilaria damaecornis

20

Halimeda monile

Halimeda opuntia

Halimeda tuna

Hydrolithon boergesenii

Hypnea cervicornis

Laurencia obtusa

21

Laurencia papillosa

Padina sanctae-crucis

Neogoniolithon spectabile

Penicillus capitatus

Neomeris annulata

Rosenvingea sanctae-crucis

22 Valonia ocellata

Sargassum fluitans Ventricaria ventricosa

Turbinaria turbinate

Wrangelia argus

1

SEAWEED RESOURCES OF PANAMA Chapter 2 SPECIES OF MACROALGAE ON GALETA POINT AT CORAL REEF SITE 16 YEARS AFTER THE OIL SPILL IN 1986. PROVINCE OF COLON, REPUBLIC OF PANAMA, 2004. GOMEZ DENIS1; PEREZ HAIDY1 AND BATISTA, VEGA G. 2 1

University of Panama, Regional Center of Colon. University of Panama, Estafeta Universitaria, Panamá. Ciudad universitaria Octavio Méndez Pereira. Web: www.up.ac.pa/ and Smithsonian Tropical Research Institute Institute Roosevelt Ave. Building 401 , Tupper Balboa, Ancon Republic of Panama. P.O. BOX 2072. 2

ABSTRACT The present study of marine macroalgae took place in Galeta Laboratory (79° 52’ O” W and 9° 24’ O” W). It was based in works done before and after an oil spill occurred April 27, 1986 in the area. The research area was a site marked by J. Cubit in 1986 on a coral reef ecosystem of 250 m long by 50 m wide. The area was divided in 10 transepts and the algae were collected within them for classification. Thirty five species belonging to the divisions Chlorophyta, Rhodophyta and Phaeophyta were found within the four samples collected between June 2002 and January 2003; (1) March 2002 (dry season), (2) June 2002 (transition dry to wet), (3) September 2002 (wet season) and (4) January 2003 (from wet to dry). Three classes, eleven orders, sixteen families and twenty four genders were identified. The classification of each specie and order included the use given to some algae by the natives of Panama. Eight species found near the samples areas are also describe in this paper.

2 INTRODUCTION There have been many ecological and biological investigations about marine algae at the laboratory in Galeta Point and surrounding areas, near the northern entrance of the Panama Canal. They have resulted in many publications. For example by 1986, there were about 130 scientific papers published, such information is rarely available in any tropical areas (Cubit et al. 1986). The publications have been increasing through the years. The first studies about the coral reefs in Galeta Point began since 1972 with Peter Glynn. He described in his research work the geographic and biological characteristics on the site object of the present study. Studies done in Galeta Point coral reefs from 1981 to 1984 by Judith Connor identified 113 species of marine algae and 39 genders; many of these had never been reported in this area. In 1986 more than 150 species of macroalgae were reported by John Cubit and collaborators in the area of study. Study of marine algae in Galeta Point will contribute with comparative knowledge about the richness and abundance of macroscopic species of marine algae (Gomez and Perez, 2004). More than 125 studies described the biota as the physical and ecological environment of the coral reef in Galeta point. These included references to: variation, distribution, abundance, reproduction, behaviour and other ecological aspects about the algae species found in these areas. This paper mentions the utilisation of the species found that the native of the area have known and utilised them for different purpose (Batista and Connor, 1982) and the following aspects: • The total of species of macroalgae found at the area study. • The total of individuals by specie. • A total of species by season considering the Dry Season March and Wet Season September there are an Intermediate Seasons: (1) between dry to wet in June, and (2) wet to dry in January 2003. • The macroalgae species most abundant by total of the individuals.

3 METHODOLOGY The site is a coral reef ecosystem of 250 meters long by 50 meters wide. It was the same site used by John Cubit in 1986 (Map 1). According to Glynn 1972, these coral reefs started to grow approximately 7,000 years ago. After the selection of the research area, we decided to apply the same methodology used J. Cubit in 1986.

Four samples where collected between June 2002 and January 2003, taking into account the season of the year: (1) March 2002 (dry season), (2) June 2002 (transition dry to wet), (3) September 2002 (wet season) and (4) January 2003 (from wet to dry). The study area was limited in ten (10) transepts of 50 meters of longitude. They were fixed with iron stakes, perpendicular to the reef from the line of the tide and separated at 20 meters intervals. The sample units by transepts were squares of 0.5 squares meters separated between them, along the transepts with a distance of 0.5 meters. In each one of the transepts we counted the number of each species found and collected the samples to be identified at the laboratory. We put them in formalin 5% to be registered and stored. In the laboratory the taxonomic identification was done by cytological slides in order to classify species with the help of Gloria Batista de Vega. We took photos of cells of the different species. The richness was determined by the number of species found; and the abundance relative by the frequency of individuals of each specie registered in each square.

4 RESULTS There is a great complexity in relation to the taxonomic classification of the algae, depending of the different authors. Following the characteristics described by the phycologists: Aylthon Brandao, July 1967; Edward Lee, 1980; Taylor, 1985; Diane Littler et al, 1989; Diane & Mark Littler, 2000; we have identified 3 phylum to macroalgae in the ten transepts within the site of study. These are: Chlorophyta, Rhodophyta and Phaeophyta. These 3 phylum were found with 35 species, 3 classes, 11 orders, 16 families and 24 genders. (Table 1). A total of 32,012 individuals were found in the 4 samples collected between March 2002 to January 2003. (1)March 2002 (dry season), (2) June 2002 (transition dry to wet), (3) September 2002 (wet season) and (4) January 2003 (from wet to dry). The division Rhodophyta had the greatest number of individuals by species. The Laurencia papillosa with a total of 12,840 individuals represented the most abundant species with the 40.1 % of the total of individuals found in the 4 samples (Table 2). The division Chlorophyta follows in importance with Halimeda opuntia as the second most abundant specie with a total of 4,065 individuals, giving the 12.69% and Penicillus capitatus the third most abundant with 4,025 individuals giving the 12.57 % of the total of the individuals in the 4 samples. During the wet season in September 2002, we found the greatest number of species with a total of 9,979 and the smallest number was found in the dry season in March 2003, with 6,715 individuals (Table 3). The smallest number of individuals by species were found in 2 phylum: Rhodophyta: with Rhipilia tomentosa In the intermediate season (dry to wet) 5 individuals were found, all in 1 sample and Chlorophyta: with Codium isthmocladum. The 5 individuals were found in each of the 4 samples. The following is a description of each of the 35 species of algae found within the ten transepts at the coral reefs of Galeta site and eight more species found at the surrounding areas.

5 PHYLUM CHLOROPHYTA Anadyomene stellata (Wulfen) C. Agardh Phylum: Chlorophyta Class: Chlorophyceae Order: Cladophorales Family: Anadyomenaceae Gender: Anadyomene Specie: stellata General Characteristics: It is a plant of foliaceous habitat expanded; more or less oval or irregular. The stem is made of a plane lamina with only one cap of cells. Plants consist of fan shaped, rounded, crisp, bright green blades up to 10 cm tall. A total of 249 individuals of a total of 32,012 individuals were found in the four samples. In the intermediate season (wet to dry) were found the largest number of 119 of individuals of this specie. Avrainvillea elliottii A. & E. S. Gepp Phylum: Chlorophyta Class: Chlorophyceae Order Caulerpales Family Halimedaceae Gender: Avrainvillea Specie: elliottii General Characteristics: It has a long stem at the end of which come out structures in form of a fan. The fan is formed by tiny filament around the edges; usually of a light green colour. This specie was found only in the wet season with a total of 32 individuals of a total of 32,012 individuals. Bryopsis pennata Lamouroux Phylum: Chlorophyta Class: Chlorophyceae Order: Caulerpales Family: Bryopsidaceae Gender: Bryopsis Specie: pennata

6 General Characteristics: It is an algae with an erect stem of few cm in height, constituted by cenocytic filaments abundance and ramified, attached to the substratum by a filamentous base. A total of the 45 individuals of the specie of a total of 32,012 individuals were found only in the dry and wet season (March 02 and Sep. 02). The greater number 43 of individuals were found in the wet season. Caulerpa cupressoides (West in Vahl) C. Agardh Phylum: Chlorophyta Class: Chlorophyceae Order: Caulerpales Family: Caulerpaceae Gender: Caulerpa Specie: cupressoides Picture No: 4 and 5 General Characteristics: It presents a long stem with small branches erected and branched out, slightly labulated of firm texture and color green. It is attached to the sandy substratum. Trabeculae are observed they are cylindrical branches growing within the wall going through the central lumen or vacuoles of the cenocite and provide mechanical support to the plant of algae. It has plastids called chloroplasts and amyloplasts. The specie was found in the four samples with a greater number of 112 individuals in the intermediate season (wet to dry). Utilizations: It is used by the Kuna Indian to cure a disease known as “Armadillo”. The person affected has accelerated breathing as if, suffering of high blood pressure, and his respiratory system is strongly affected. The algae is mixed with corals and epiphytes in a pot adding fresh water. Later, they boil it and make a tea. It is also used for menstrual problems. The name in Kuna Language is ansukila (Batista, 1992). Caulerpa racemosa Agardh Phylum: Chlorophyta Class: Chlorophyceae Order: Caulerpales Family: Caulerpaceae Gender: Caulerpa Specie: racemosa

(Forsskäl)

J.

7 General Characteristics: Its present branch in form of grapes, the trunk is attached to a rocky sustratum and it has a soft texture. This specie was found in the four samples (mar 02, June 02, Sep. 02 and Jan. 03). The greater number of individuals were found at the dry season 89 and in the wet season 88. tilization: It is prepared by the Kuna Indian to cure a disease known as “Pato” (Duck). The sick person presents a long face and bulgy eyes. These algae are dried and prepared as tea. They are used to clean the face of the affected person. The name in Kuna Language is muguse (Batista, 1992). Caulerpa sertularioides (S. G. Gmelin) M. Howe Phylum: Chlorophyta Class: Chlorophyceae Order: Caulerpales Family: Caulerpaceae Specie: sertularoides General Characteristics: Algae of erect form anchored to a sandy sustratum, it has branches as small palms attached to the same stem. Long, erect, light green, feather like blades (15-20 cm tall). These stems are fixed to the sustratum by its roots called rhizoids. This was the sixth specie with a greater number 770 of individuals of a total of 32,012 individuals. It was found in all the samples done (Mar. 02, June 02, Sep. 02 and Jan.03). The greater numbers of individuals of this specie 345 were found in January at the intermediate season (wet to dry). tilization: It is used by the Kuna Indian to cure a house of the presence of Satan; each member of the family who is possessed ought to drink the tea while the Inaduledi sings. The name in Kuna Language is manikidu (Batista and Connor, 1990). Codium isthmocladum Vickers Phylum: Chlorophyta Class: Chlorophyceae Order: Caulerpales Family: Codiaceae Gender: Codium Specie: isthmocladum General Characteristics: It presents a spongy stem and branched out with endings in a tubular form. It is bushy, erect, dark green and up to 20 cm tall,

8 with fine hairs arising from the soft, spongy, smooth surface. It was no cellular wall and it is considered the biggest organism formed by a singular cell. This specie shows with Rhipilia tomentosa the smallest number of 5 individuals of a total of 32,012 individuals found. It was present in the four samples (March 02, June 02, Sep. 02 and Jan. 03). The five individuals were found distributed in the four samples with the greater numbers of 2 individuals in dry season.

Dictyosphaeria cavernosa (Forsskäl) Boergesen Phylum: Chlorophyta Class: Chlorophyceae Order: Siphonocladales Family: Valoniaceae Gender: Dictyosphaeria Specie: cavernosa General Characteristics: It is a hard algae in form of a ball, hallows and not well formed; sack like and the sphere wall is composed of one layer of lager angular or polygonal cells clearly visible with unaided eye. It has rhizoids to attach itself lightly to the susbstratum, usually a rocky one. The young growth is formed by global sacks, rigid, of a green color, full of water and of irregular surface. A total of the 395 individuals of the specie of a total of 32,012 individuals were found in the four samples (mar 02, June 02, Sep. 02 and Jan. 03). The greater number 210 of individuals were found in the wet season. Utilization: It is used by the Kuna Indians to cure a disease known as “Armadillo” as in Caulerpa cupressoides and Halimeda opuntia. The name in Kuna Language is mupate (Batista, 1992). Halimeda discoidea Decaisne Phylum: Chlorophyta Class: Chlorophyceae Order: Caulerpales Family: Halimedaceae Gender: Halimeda Specie: incrasata General Characteristics: Erect stem, compact, constituted in Segments of various forms. Strongly calcified separated by flexible knots and attached to the substraum by a short peduncle or stem.

9 A total of the 225 individuals of the specie of a total of 32,012 individuals were found in the four samples (mar 02, June 02, Sep. 02 and Jan. 03). The greater number 122 individuals were found in the intermediate season (dry to wet). Halimeda incrassata (Ellis) J. V. Lamouroux Phylum: Chlorophyta Class: Chlorophyceae Order: Caulerpales Family: Halimedaceae Gender: Halimeda Specie: incrasata General Characteristics: It is of calcified and hard consistence. It has structures in form of flakes, united on top of the other in an erected form. It is composed of heavily calcified, brittle, dislike, distinctly ribbed and somewhat label segments; connected by non-calcified flexible joints. The fifth specie with the greater number 1603 of individuals of a total of 32,012 individuals. It was found in four samples (mar. 02, June 02, Sep. 02 and Jan. 03). The greater number 528 of individuals appeared in wet season. Halimeda monile (J. Ellis & Solander) J. V. Lamouroux Phylum: Chlorophyta Class: Chlorophyceae Order: Caulerpales Family: Halimedaceae Gender: Halimeda Specie: monile General Characteristics: They present a stem branched out but erect. The branches have a cylindrical form of hard consistence and calcified. Flattened, dark green segments connected by flexible joints; it reaches 20 cm tall. It is attached to the substratum by a group of rhizoids. It was the fourth specie most abundant with 3,232 of individuals of a total 32,012 individuals. It was found in the four samples. The greater number 798 of individuals were found in the transition season dry to wet.

10 Halimeda opuntia (Linnaeus) J. V. Lamouroux Phylum: Chlorophyta Class: Chlorophyceae Order: Caulerpales Family: Halimedaceae Gender: Halimeda Specie: opuntia General Characteristics: It is a calcified alga and hard consistency. It branches out in form of oats flakes very close together, forming small hills of leaves very united and usually they are found in all substrata. This specie was the second most abundant specie with 4,065 individuals of a total of 32,012 individuals. It was present in the four samples (March 02, June 02, Sep. 02 and Jan. 03). The largest number 1418 of individuals of the specie were found in the intermediate season (wet to dry). Utilization: It is used by Kuna Indians to cure a disease known as “Armadillo” the some procedure that with Caulerpa racemosa. The name in Kuna Language is Disaki, with epiphytes dibuido, and with epiphytes and coral susiki (Batista, 1992). Halimeda tuna (Ellis & Solander) J. V. Lamouroux Phylum: Chlorophyta Class: Chlorophyceae Order: Caulerpales Family: Halimedaceae Gender: Halimeda Specie: tuna General Characteristics: Consists of an erect stem or tall strongly calcified with segments separated by knots, forming groups on a surface. A total of the 186 individuals of the specie of a total of 32,012 individuals were found in the four samples (mar 02, June 02, Sep. 02 and Jan. 03). The greater number 166 of individuals were found in the intermediate season (dry to wet).

11 Neomeris annulata Dickie Phylum: Chlorophyta Class: Chlorophyceae Order: Dasycladales Family: Dasycladaceae Gender: Neomeris Specie: annulata General Characteristics: it is an algae of soft consistency, color green and white, of cylindrical form, usually attached to a rocky sustratum by rhizoids. This specie was found only in the wet season and the intermediate season (wet to dry) with a total of 33 individuals of a total of 32,012 individuals. The largest number of 29 individuals of this specie was found in the wet Season. The name in Kuna Language is nonoligudu.

Penicillus capitatus Lamarck Phylum: Chlorophyta Class: Chlorophyceae Order: Caulerpales Family: Halimedaceae Gender: Penicillus Specie: capitatus General Characteristics: This is an algae of erect form with a long stem at the end. It was the third specie more abundant with 4,025 of a total of 32,012 individuals. This specie was found in the four samples. (Mar. 02, June 02, Sep. 02 and Jan. 03). The largest number of the individuals were 1,747 in the dry season. Utilization: Kuna Indians used to cure of bad spirits. They are prepared as tea, and given to sick people to drink while the Inaludeli sings and insults with bad words to send away Satan. The name in Kuna Language is mupate (Batista, 1992). Rhipilia tomentosa Kuetzing Phylum: Chlorophyta Class: Clorophyceae Order: Caulerpales Family: Udoteaceae Gender: Rhipilia Specie: tomentosa

12 General Characteristics: This algae of erect habit, structurally compound by filaments, coenocytic and uniseriate, compacted and spongy texture of rounded form attached to the substratum. This specie shows with Codium isthmocladum the smallest number of 5 individuals of a total of 32,012 individuals found only at the intermediate season (dry to wet). Valonia ocellata Howe Phylum: Chlorophyta Class: Chlorophyceae Order: Siphonocladales Family: Valoniaceae Gender: Valonia Specie: ocellata General Characteristics: The plants have globoid stems (balloons form) coenocytic; solid and compact, attached firmly to the substratum by numerous rhizoids; with big vegetative cells; microscopic and of angular contour with numerous chromatophores, polygonal rounded in shape with one or three pyrenoids. 279 individuals specie of a total of 32,012 individuals were found in the four samples (mar 02, June 02, Sep. 02 and Jan. 03). The greater number 176 of individuals were found in the wet season. Ventricaria ventricosa (J. Agardh) J. L. Olsen & J. A. West Phylum: Chlorophyta Class: Chlorophyceae Order Siphonocladales Family: Valoniaceae Gender: Ventricaria Specie: ventricosa General Characteristics: It is an algae of soft texture. It is formed by one cell. It may grow in groups or as individuals. Plants look like large glass marbles or small balloons with a bright reflective glare and consist of large (up to 5cm diameter) dark green the walled oval or spherical single cells one of the largest cells known in science. The specie is attached by substratum by minute, hairlike rhizoids. A total of 194 individuals of a total of 32,012 individuals were found in the four samples. The greater number 100 of individuals were found in the wet season.

13 PHYLUM RHODOPHYTA Acanthophora spicifera (Vasl) Borgensen Phylum: Rhodophyta Class: Florideophycidae Order: Ceramiales Family: Rhodomelaceae Gender: Acanthophora Specie: spicifera General Characteristics: A stem erected, cylindrical, with growing in locks: an organisation of ramifications attached to the substratum with a long rhizoid. Its apical cell is visible. A total of 413 individuals of a total of 32,012 individuals were found in samples 1, 3 and 4 (mar 02, Sep. 02 and Jan.03). It was not found at the intermediate season (dry to wet). The greater number was found in the 214 individuals intermediate season (wet to dry). Utilization: It is used by Kuna Indians to cure a disease known as “Armadillo” as Caulerpa cupressoides, Halimeda opuntia and Dictyosphaeria cavernosa. It is also used for menstrual problems. The name in Kuna Language is digua (Batista, 1992). Amphiroa rigida J. V. Lamouroux Phylum: Rhodophyta Class: Florideophycidae Order: Corallinales Family: Corallinaceae Gender: Amphiroa Specie: rigida General Characteristics: It is a plant formed in clusters; strongly calcified, dichotomous branches, not articulated in the point of branching or junction. Branches segmented not similar; could be of 1-2 mm segments long and cylindrical, articulations with two transversal zones. A total of 43 individuals of a total of 32,012 individuals were found in the samples 2, 3 and 4. (June 02, Sep. 02 and Jan. 03). It was not found in the wet season. The largest number obtained in the intermediate season (dry to wet) with 31 individuals.

14 Amphiroa tríbulus (Ellis & Solander) J. V. Lamouroux Phylum: Rhodophyta Class: Florideophycidae Order: Corallinales Family: Corallinaceae Gender: Amphiroa Specie: tribulus General Characteristics: It has an erected stem, it grows in dense locks, strongly impregnated of calcium carbonate; formed in flat segments laterally expanded. A total of 49 individuals of a total of 32,012 individuals were found only in the intermediate season (dry to wet) and the wet season. The greater number was obtained in the intermediate season (dry to wet) with 36 individuals. Galaxaura oblongata (Ellis & Solander) J. V. Lamouroux Phylum: Rhodophyta Class: Florideophycidae Order: Nemaliales Family: Chaetangiaceae Gender: Galaxaura Specie: oblongata General Characteristics: Big stem, cylindrical, organised uniaxially. Central filaments originate vertically, short branches that are abundant and are organised in a continuous cellular cap or cystocarp, peduncular organisation. This specie was not found in the intermediate season (dry to wet). A total of 42 individuals of a total of 32,012 individuals were found. The largest number 22 of individuals were found in the dry season. The name in Kuna Language is dinaki (Batista, 1992). Gelidiella acerosa (Forsskäl) J. Feldmann & Hamel Phylum: Rhodophyta Class: Florideophycidae Order: Gelidiales Family: Gelidiellaceae Gender: Gelidiella Specie: acerosa General Characteristics: It has a stem cylindrical, flat and solid. Usually small and attached to a substratum by rhizoids. Growing in apical form and

15 presents an uniaxial organisation; in the central disk grows some lateral filaments that branch out. A total of 686 individuals of the species of a total of 32,012 individuals were found within the 4 samples. The greater number was obtained in the wet season with 318 individuals. Gelidium pusillum (Stackhouse) Le Jolis Phylum: Rhodophyta Class: Florideophycidae Order: Gelidiales Family: Gelidiellaceae Gender: Gelidium Specie: pusillum General Characteristics: It presents a cylindrical stem more or less flat and solid. It has growths by apical cells, uniaxial organisation: the medullar region is made of big cells and the cortical region by smaller cells. A total of 64 individuals of a total of 32,012 individuals were present only at the intermediate seasons dry to wet and wet. The greater number was obtained in the wet season with 34 individuals. Gracilaria cervicornis (Turner) J. Agardh Phylum: Rhodophyta Class: Florideophycidae Order: Gigartinales Family: Gracilariaceae Gender: Gracilaria Specie: cervicornis General Characteristics: It has a membranous thallus; the last divisions are sub-dichotomous, segmented from its basal margin with short and dented projections. The cystocarp is formed in its thinnest segment, more or less marginal, hemispheric and apical. A total of 20 individuals of a total of 32,012 individuals were found only at the intermediate season (wet to dry). Utilization: the Kuna Indians drink it as a hot tea to cure menstrual disorders. The name in Kuna Language is canacua (Batista, 1992).

16

Gracilaria damaecornis J. Agardh Phylum: Rhodophyta Class: Florideophycidae Order: Gigartinales Family: Gracilariaceae Gender: Gracilaria Specie: damaecornis General Characteristics: It is cartilaginous plant with stem of 7-15 cm; with dichotomous branches very irregular grouped together, the last segments are usually short and erected. A total of the 6 individuals of a total of 32,012 individuals were present in samples 1, 2, 3 (mar 02, June 02 and Sep. 02). It was not found at the intermediate season (wet to dry). The greater number 3 of individuals were found in the dry season. Laurencia obtusa (Hudson) J. V. Lamouroux Phylum: Rhodophyta Class: Florideophycidae Order: Ceramiales Family: Rhodomelaceae Gender: Laurencia Specie: obtusa General Characteristics: it is known for having a color between green and yellow; it is branches are pink, alternated, small and short. The last branches may be compound or subverticillated. A total of 38 individuals of the species of a total of 32,012 individuals were found. The specie was not found in the intermediate season (wet to dry). The greater number 34 of individuals were found in the wet season. Utilization: It is prepared to cure a disease known as “Pato” (Duck). The symptoms are: a long face and bulgy eyes. These algae are dried and later are used to prepare tea. They are used to wash the face of the affected person. The name in Kuna Language is disaki (Batista, 1992). Laurencia papillosa (C. Agardh) Greville Phylum: Rhodophyta Class: Florideophycidae Order: Ceramiales Family: Rhodomelaceae Gender: Laurencia Specie: papillosa

17 General Characteristics: It is known as being a very dense plant, cartilaginous; the branches have primary axes alternated, presents cortical cells in radial sections, lobal branches; usually the clusters on the branches are fertile. They grow very much in zone of current waters. It was the most abundant specie of the 35 species found. A total of 12,840 individuals of a total of 32,012 individuals were present in the four samples (mar 02, June 02, Sep. 02 and Jan. 03). The intermediate season (wet to dry) with 4,554 individuals with more number of individuals. Neogoniolithon spectabile (Foslie) Setchell & Mason Phylum: Rhodophyta Class: Florideophycidae Order: Cryptonemiales Family: Corallinaceae Gender: Neogoniolithon Specie: spectabile General Characteristics: It is a hemispherical calcareous algae attached to a rocky substratum. It has protuberances of various sizes and dichotomous and irregular branches. A total of 354 individuals of the species of a total of 32,012 individuals were found in all of the four samples. The largest numbers was found in the wet season with 143 individuals. Wrangelia Argus (Montagne) Montagne Phylum: Rhodophyta Class: Florideophycidae Order: Ceramiales Family: Ceramiaceae Gender: Wrangelia Specie: argus General Characteristics: It has a stem erected and with filaments; cylindrical, branched out, growing by apical cells forming a central disk. A total of 81 individuals of a total of 32,012 individuals were found only in the dry season and intermediate season (dry to wet). The greater numbers were found in the dry season with 75 individuals.

18 PHYLUM PHAEOPHYTA Dictyoptheris delicatula J. V. Lamouroux Phylum: Phaeophyta Class: Dictyotales Order: Dictyotales Family: Dictyotaceae Gender: Dictyoptheris Specie: delicatula General Characteristics: Erected stems, small about 2 to 8 cm, its branches are dichotomous or irregulars, presents a double cellular membrane; the margins are longitudinal and inconspicuous, elongated. A total of 403 individuals of the specie of a total of 32,012 individuals were found in the four samples. The largest number was found in the intermediate season (wet to dry) with 234 individuals. Dictyota cervicornis Kützing Phylum: Phaeophyta Class: Phaeophyceae Order: Dictyotales Family: Dictyotaceae Gender: Dictyota Specie: cervicornis General Characteristics: Erect thallus or stem, flattened and ramified dichotomousy with nervous ends. This thallus is attached in the substratum by a rhizoidal mass. A total of 20 individuals of a total of 32,012 individuals were found only at the intermediate season (dry to wet). Dictyota divaricata J. V. Lamouroux Phylum: Phaeophyta Class: Phaeophyceae Order: Dictyotales Family: Dictyotaceae Gender: Dictyota Specie: divaricata General Characteristics: Flat, erected stems; attached to substratum by a rhizoidal mass usually ramified dichotomously with growth from distinct apical cells; the stem is composed by three litters of cells, two external and one epidermal.

19 A total of 744 individuals of a total of 32,012 individuals were found in samples 1, 2 and 3 (Mar. 02, Jun 03 and Sep. 02). It was found in the dry season with 493 individuals. Utilization: It is used to treat a disease known as “Sirena”. It happens when a pregnant woman goes to the sea and sees a fish with the face of a man. The name in Kuna Language is disamo (Batista, 1992). Padina sanctae-crucis Boergesen Phylum: Phaeophyta Class: Phaeophyceae Order: Dictyotales Family: Dictyotaceae Gender: Padina Specie: sanctae-crucis General Characteristics: Erected stem, foliaceous, expanded. Lightly impregnated of calcium carbonate; attached to the substratum by thick rhizoids. A total of 46 individuals of a total of 32,012 individuals were found in the four samples (Mar. 02, Jun 03, Sep. 02 and Jan.03). The greater number of individuals was found in the wet season with 38 individuals. Utilization: It is prepared as tea, although it is also used in baths (Batista,1992). Rosenvingea sanctae-crucis Boergesen Phylum: Phaeophyta Class: Phaeophyceae Order: Scytosiphonales Family: Scytosiphonaceae Gender: Rosenvingea Specie: sanctae-crucis General Characteristics: An erected stem, ramified with branches more or less cylindrical composed by big and no coloured cells, rich in chromatophores, tubes of pluricellular hairs located irregularly on the surface of a frond and it has a growing by meristematic apex. A total of 282 individuals of a total of 32,012 individuals were found in samples 1, 2 and 3 (Mar. 02, Jun.02, Sep. 02). The largest number was found in the dry season with 139 individuals.

20 THE EIGHT SPECIES FOUND NEAR THA SAMPLES AREAS The 8 species we are presenting now were found in areas surrounding the area of study. They are described as follows: PHYLLUM: CHLOROPHYTA Acetabularia calyculus Quoy & Gaimard Phylum: Chlorophyta Class: Chlorophyceae Order: Dasycladales Family: Polyphysaceae Gender: Acetabularia Specie: calyculus General Characteristics: Erected stem cenocytic. When it is adult, it is composed of a peduncle that holds a light green calcified disk transversally attached to the substratum by rhizoids.

Enteromorpha flexuosa (Wulfer ex Roth) J. Agardh Phylum: Chlorophyta Class: Chlorophyceae Order: Ulvales Family: Ulvaceae Gender: Enteromorpha Specie: flexuosa Characteristics of the gender: They present an erect stem, filaments; it has a tubular form and it is composed by a cap of cells disposed in radial form, limited in a central cavity.

21 PHYLLUM: RHODOPHYTA Hydrolithon boergesenii (Foslie) Foslie Phylum: Rhodophyta Class: Florideophycidae Order: Cryptonemiales Family: Corallinaceae Gender: Hydrolithon Specie: boergesenii General Characteristics: It is impregnated with calcium carbonate. Its stem is composed by filaments. It presents a continuous marginal growing; it has tetrasparangia that reproduce in conceptacles. Slightly elevated on surface of frond in a circular ambit or circuit. Gracilaria mammillaris (Montogne) M. Howe Phylum: Rhodophyta Class: Florideophycidae Order: Gigartinales Family: Gracilariaceae Gender: Gracilaria Specie: mammillaris General Characteristics: It is red algae with dichotomous ramifications, also cylindrical, attached to a rocky substratum. It may grow up to 10cm. Utilization: It is used by the Afro Antilleans as an aphrodisiac drink; prepared in soup, puddings, and with cereals. Gracilarias are sold drugstores in Colon and Panama city (Batista, 1992). Chondria littoralis Harvey Phylum: Rhodophyta Class: Florideophycidae Order: Ceramiales Family: Rhodomelaceae Gender: Chondria Specie: littoralis General Characteristics: It presents a stem cylindrical or flat, erected. It is attached to substratum by many rhizoids organised with short, lateral branches is elliptical oval form. Its cystocarp is ovoid.

22 Hypnea cervicornis J. Agardh Phylum: Rhodophyta Class: Florideophycidae Order: Gigartinales Family: Hypneaceae Gender: Hypnea Specie: cervicornis General Characteristics: The plant has a cylindrical stem. It is very ramified with numerous short branches. Its growing is in apical form, its medullary region is dense or thick; composed by big cells of polygonal contour, with no color and circular or rounded. The cortical region is formed by small cells, rich in chromatophores.

PHYLLUM: PHAEOPHYTA Turbinaria turbinate (Linnaeus) Kuntz Phylum: Phaeophyta Class Phaeophyceae Order: Fucales Family: Cystoseiraceae Gender: Turbinaria Specie: turbinata General Characteristics: They are erected plants, simple, with cylindrical ramifications. They transport numerous clusters, radial and short. They have the form of a fan. Utilization: It is used by the Kuna Indians to cure a disease known as “Turtle”. The patient presents deformities in the head (smaller than normal heads). They are prepared in a hot tea. The name in Kuna Language is muop (Batista, 1992). Sargassum fluitans (Boergesen) Boergesen Phylum: Phaeophyta Class: Phaeophyceae Order: Fucales Family: Sargassaceae Gender: Sargassum Specie: fluitans General Characteristics: Erected stem, ramified, with fronds in elliptic form, peduncles with various central nervous lines and crenulate or dented

23 margins. Other short branches also with peduncles transport vesicles of small size called buoys or floating items. Utilization: Kuna Indians prepare a tea, given to cure kidney diseases. It is used by Afro Antilleans descent as aphrodisiac, and also as a fertiliser on coconut and tomato plantations. The name in Kuna Language is mubarri (Batista, 1992). DISCUSSION The Laurencia papillosa species, is still in the year 2003, the most abundant species in the studied area, at the coral reefs platform reported by John Cubit and collaborators in 1985.

Laurencia papillosa total individuals found in the study represented the 40.11% of the 35 species identified at the study area. The great number of individuals of the Laurencia papillosa found in our study, aggress with John Cubit when he found an increase coverage of the same specie of 54% higher than the pre spill coverage in 1986. Halimeda opuntia was the second more abundant in this recent study with 12.57% of the total of the species found. This is in contrast with J. Cubit findings in 1987 after the spill when he reported that Halimeda opuntia suffered a reduction in abundance in September 1986 after the spill. This information is showing that the specie has not only survived but has recuperated its growing phase. In contrast with J. Cubit, who reported in 1986 that Acanthophora specifera was the second algae in abundance. We have found Acanthophora specifera in 2002 the ninth specie among the most abundant in our study. Judith Connor in 1984 reported 40 species in the same site. D. Gomez and collaborators, 18 years after, has found 35 species in the same areas (Table 4). According to the phylum; the Chlorophyta 15 species had been reported by Connor. Dennis Gomez in 2002, found 18 species of the Chlorophyta. The

24 findings of Connor were 4 species for the phylum Phaeophyta while D. Gomez found 5 species in this phylum. These results are quite similar for both parts. But in the phylum Rhodophyta is where the results show a great difference. J. Connor reported 21 species in 1984 while D. Gomez only 12 in 2002. This is an indicator that something different has happened with the Rhodophyta and it would be interesting to investigate. These type of comparisons are possible in an unique area where records have been kept and analysed for years such as Galeta Point located at the Caribbean side of the Panama Canal. It was also interesting to find that only three species of the 35: Rhipilia tomentosa, Gracilaria cervicornis (Rhodophyta) and Avrainvillea elliottii (Chlorophyta) were found only in one of the fourth samples within the ten transepts but in different seasons: transition season (dry to wet), wet and dry season respectively.

REFERENCES •

Batista de Yee, G. y Connor J. Enero 1982. Estudios de las Algas colectadas en la Costa del Caribe de Panamá, su utilización y posible uso comercial. En Memorias, IV Simposio Latinoamericano de Acuicultura, Panamá. Asociación Latinoamericana de Acuicultura (Eds).

•

Batista, G. and Connor J. December 1990. Native Uses of Seaweeds in the Republic of Panama. Annotated Bibliography of the Seaweeds used for food in the West Indies. OECS Fisheries Report No3.7-8. Caribbean Natural Resource Institute (CANARI) St. Lucia (Eds).

•

Batista, G. 1992. Gracilaria sp. Sea Farm on the Atlantic Coast of Panama in Connection with Establishment of a Nature Reserve with and Economic Purpose. Submitted to the Forestry Department, University of California, Berkeley in partial fulfillment for the Master of wild land Resources Science degree.

•

Brandao, A. 1967. Generos de algas marinhas da costa atlantica latinoamericana. Editora da Universidad de Sao Paulo. Pag: 461.

•

Connor, J. 1984. Seasonal Changes in an Algal Community of the Tropical Fringing Reef in Panama. Submitted in partial satisfaction of the requirements for the degree of Doctor in Philosophy in Botany, University of California, Berkeley.

•

Cubit, J.; Thompson, R.; Caffey, H. M. and Windsor, D. M. 1986. Hydrographic and meteorological studies of a Caribbean fringing reef at Punta Galeta, Panama: Hourly and Daily variations for 1977-1985. Smithsonian Contributions to the Marine science.

•

Glynn, P. W. 1972. Observations on the Ecology of the Caribbean and Pacific coasts of Panama. Bull. Biol. Soc. Wash. 2 : 13-30. Gomez, D. and Perez, H. 2004. Richness and Abundance of Macroscopic Species of Marine Algae. Tesis Licenciatura, Universidad de Panama, Panama. Lee, R. E. 1980. Phycology. First edition. Printed and bound in the United States of America by Vail-Ballou Press, Inc., Binghamton, NY. Pag: 478.

• •

25 • • •

Littler, D.; Littler, M.; Bucher, K. and Norris, J. 1989. Marine Plants of the Caribbean a Field Guide from Florida to Brazil. Smithsonian Institution Press Washington, D.C. Littler, D. and Littler, M. 2000. Caribbean Reef Plants Identification guide to Reef Plants of the Caribbean, Bahamas, Florida and Gulf of Mexico. Off shore Graphics, Inc., Washington D.C. Taylor, W. R. 1985. Marine Algae of the Eastern Tropical and Subtropical Coasts of the America. Published in the United States of America by the University of Michigan press and simultaneously in Rexdales, Canada, by John Wiley & Sons Canada, Limited Manufactured in the United States of America. Pag. 870.

• • • TABLES

26

27

28

1

SEAWEED RESOURCES OF PANAMA Chapter 3 USE OF THE SEAWEEDS RESOURCES ON THE CARIBBEAN COASTLINE, PROVINCE OF COLON, PANAMA AND ITS POTENTIAL ECONOMIC POSIBILITIES GLORIA BATISTA DE VEGA1 AND RAUL YEE 2 1

Vice-Presidency of Extension, University of Panama and Gracilarias de Panama S.A. University of Panama Estafeta Universitaria, Panamá. Ciudad universitaria Octavio Méndez Pereira. Web: www.up.ac.pa/ 2 Gracilarias de Panama S.A. Techno Park of the City of Knowledge, Clayton, Panama. P.O. Box 6-7483, Republic of Panama. E-mail: [email protected]

INTRODUCTION Although the marine algae of Panama are not well studied, they are used by some ethnic groups as fertilisers, as food and for medical purposes. phycocolloid extracts of algae such as agar, carrageenan and alginate are imported by some Panamanian industries in Panama for use as emulsifiers, stabilisers and thickening agents. The harvesting and use of seaweeds called seamoss by the Caribbean people have been part of their culture (Smith, 1986, 1997). A survey of the Caribbean coast of Panama including Colon city was conducted to identify how the marine algae are used in Panama, and the commercial potentiality. The study surveyed algal use in Colon city and Panama City, sales of seaweeds in drugstores and other small businesses, and importers of algae extracts from outside Panama. The Caribbean Sea contains many hundreds of species of seaweeds. About 10 species are used for food by the West Indians. The most popular are species of Gracilaria and Eucheuma (Smith, 1997). Trade is mainly in dried seamoss that has been bleached by washing and drying in the sun. Recently some countries, such as Jamaica, Grenada and Saint Lucia, have started producing bottled seamoss is exported to Trinidad and Barbados. Cultivation of Gracilaria and Eucheuma species of red algae, called seamoss by the Caribbean people was established in 1996 in Sta. Lucia (the Caribbean moss bulletin, 1996).

2 A BRIEF BACKGROUND OF THE POPULATION ON THE PROVINCE OF COLON, CARIBBEAN COAST The population of Colon province consists mainly of Panamanians of Afro-Antillean descent and a population descended from early slaves and Spanish colonists. Many of the Kuna, aboriginal natives of the coastal Panama-Colombia region, maintain tribal areas on the Caribbean Coast as well as their systems of political, cultural and social organisation. Since the early 1850s, during the Gold Rush Period, the inhabitants of Martinique, Guadalupe, Barbados, Jamaica and others Islands from the Caribbean came to Panama for the construction of the Rail Road and later for the construction of the French Canal, since 1900 started a massive immigration to work in construction of the Panama Canal built by the Government of the United State of American. Memories of the French Canal are still present in the coastline of the Province of Colon. Descendants of immigrants from Jamaica, Guadalupe, Martinique and other Antillean islands can still be recognised in the province of Colon because of their French surnames and customs. These immigrants introduced the use of brown algae such as Sargassum spp as fertiliser in plantations of coconuts and tomatoes The use of isinglass, an invigorating popular vitamin drink, made with species of red algae of Eucheuma and Gracilaria is well known in the area. The name of isinglass it is said to be of Dutch origin probably by folk etymology. The pronunciation has changed. Soldiers used prepared beverage called isinglass to protect their stomachs in the I and II War World (personal communication from the native of the area). The inhabitants, who live along the shoreline in places such as La Playita, Maria Chiquita, Playa Langosta, Garrote, La Guayra and Isla Grande were visited in 1981 by Gloria Batista. Periodically, other interviews have been conducted in the same places by university students. INTERVIEWS TO THE INHABITANTS OF COMMUNITIES IN THE PROVINCE OF COLON ON THE CARIBBEAN COAST. Approximately 100 inhabitants between 18 and 73 years old were interviewed and those who said they knew about algae were asked to collect the species they used and describe how they utilised the product. The species collected were obtained by diving and brought to the laboratory for identification. Each species of algae was identified by microscopy, using a 5 mm sample of each to prepare histological sections 24 u thick with a freezing microtome. These species were identified as those used by local inhabitants: Sargassum natans is utilised as fertiliser on tomato and yucca plantations. Turbinaria sp. (Photo 10) and Sargassum sp. (Photo 8) were used to make tea to treat kidney ailments (Batista and Connor, 1982).

3 Gracilaria mamillaris (Photo 5) and Gracilaria crassisima (Photo 4) used to prepare refreshment drinks called sea moss or isinglass and medical syrups which were consumed as energy fortifiers and aphrodisiacs. Recently, the women from Colon Province are using the algae as a vitamin supplement and they extract the colloids to make milkshake or cereal for their babies. INTERVIEWS IN URBAN ZONES IN COLON CITY AND PANAMA CITY Samples of algae were purchased for taxonomic study in drugstores in the 2 main cities of Panama. In the City of Panama of 106 drugstores, visited, it was found that algae were sold in 62 of them. In Colon city of the 14 drugstores visited 13 sold algae, with constant demand. Customers asked for algae under various names, such as Irish-moss, liquen seamoss or algae. The algae served a diversity of purposes: as an aphrodisiac; a vitamin enrichment; as antibiotics; to control weight; and in the preparation of refreshments. Customers asked for the algae according to their needs, but without knowledge of the properties of the species they were buying. An exception was purchases of red algae, which were used in cooking, added to soup and boiled. In addition, the AfroAntillean descendants extract the colloids of these red algae to make a gelatinous pudding, or milkshake or a special drink for men called isinglass. Some of the latest interviews indicate that women also used it as a cereal in their children's diets. The algae from drugstores identified were: Chondrus crispus, Gracilaria debilis, Gigartina sp. possibly imported from Hamburg, Germany; Gymnogongrus tenuis from the San Blas Islands in Panama; and Gracilaria cylindrical of unknown origin. A small quantity of algae sold in the drugstores came from the Caribbean Coast of Panama. Oriental stores and restaurants were visited with the following observations: restaurants and stores imported algae from Japan, as nori (Porphyra), Kon Kambu (Laminaria), to prepare their dishes. Twelve companies engaged in the importation of algae extracts were also visited. The extracts are used in the food industries as a stabiliser or thickening to obtain products as milks, cheese, mayonnaise, ice-cream, fan, etc. In the dental industry, the extracts are used to give consistency to the dental creams. Since 1990, small quantities of Eucheuma species started to be sold in the local market, Colon city, by Afroantillean descents to make soups and as cereal for children.

4

Photo 1 Acanthophora specifera

Photo 4 Gracilaria crassissima

Photo 2 Caulerpa racemosa

Photo 5 Gracilaria mammillaris

Photo 3 Caulerpa sertularioides

Photo 6 Hypnea musciformis

5

Photo 7 Laurencia papillosa

Photo 9 Sargasum natans

Photo 8 Sargassum sp.

Photo 10 Turbinaria sp.

6 CONCLUSIONS AND SUGGESTIONS Marine algae are used in Panama industry, agriculture and feeding. Some species are collected here; others are imported. Industries visited import extracts of algae such as agar-agar, carrageenan and alginate for elaboration of food products such as cheese, ice cream, flans, and other derivates from milk; also, in the fabrication of dental cream. They are also used in medicine and in the production of beer. On the coast line area between Colon city and Isla Grande, in places as La Playita, Maria Chiquita, Playa Langosta, Garrote, La Guayra and Isla Grande the following species were collected.  Turbinaria sp. (Photo 10 ) and Sargassum natans (Photo 9 ). These two species are used by ascendants of immigrants of the Antilleans Islands as fertilisers and medical teas. They are also used to treat kidney diseases.

 Gracilaria mammillaris (Photo 5 ) and Gracilaria crassissima (Photo 4 ) These two species are used in the elaboration of invigorating drinks, to increase sexual activity and to make soups. These algae collected along the Panamanian coast have the same quality of those imported and sold in drugstores. The Chemical analysis was made by The Specialised Institute of Analysis of the University of Panama. (Unpublished data, 1996). The Gracilaria species of Panama play an important role in the international market for the production of agar. The world demand of agar for 1983 was 7,000 tm. In 1991, the production of Gracilaria for cultivation in Chile reached the 58,000 tm (FAO, 1993). All the species of algae identified used by the inhabitants of Panama have a great economic potential and are used in other parts of the world. For example:  Sargassum sp. (File JPGE Use of the Seaweeds Resource on the Caribbean Coastline. Photo 8) and Hypnea musciformis (File JPGE Use of the Seaweeds Resource on the Caribbean Coastline. Photo 6) Species of Sargassum have been considered in Brazil as a potential resource for the industry of alginates and to be substituted by agar (FAO, 1993). Hypnea musciformis is exploited in Brazil, to produce 10 and 20 tons of Kappa carrageenan (Maria Luz Piriz, 1993). It is also used as a food in West Indians countries (Smith, 1990).  Laurencia papillosa (File JPGE Use of the Seaweeds Resource on the Caribbean Coastline. Photo7) and Acanthophora specifera (File JPGE Use of the Seaweeds Resource on the Caribbean Coastline. Photo 1)

7 Laurencia papillosa produce different metabolites that have potential antibiotic (Fenical, 1982), is the most abundant on the Caribbean coast of Panama and Acanthophora specifera, this specie is used as food in Europe, Hawaii and Japan (Chapman, 1970). 

Caulerpa racemosa (Photo 2) and Caulerpa sertularioides (Photo 3)

These species could be used for human feeding in salads and are eaten raw in Philippines. Studies by Oliveira at the University of Sao Paulo in Brazil, show concern about the exploitation of algae due to a considerable decline of the natural populations. In 1974, Brazil exported 2,300 tons of the Gracilaria sp. and Hypnea musciformis, but in 1979 exported only 250 tons. This lessening of 446% occurred for the excess in exploitation in such an extensive coast as it is in Brazil (Oliveira 1981, 1990). The coast of Panama is small compared with that Brazil. We recommend that all the projects for exploitation of marine algae in Panama should be based on clear, firm and consistent plans for the management of the natural population of algae. Either in the field or cultivated in farms, this resource has to be protected. The collection of algae in their natural habitats could reduce or eliminate genotypes necessary to obtain the best stocks for cultivation. The collection of seaweeds from the field must be done carefully with the purpose to initiate its cultivation, taking only the necessary parts for reproduction. Since 1996, the Utilization of algae has been increasing in Panama in a massive form. For this reason and for the best economic interest of Panama, we recommend the installation of polycultivation of algae with shrimps or crabs as it is done successfully in farms of Gracilaria in Taiwan (Chen, 1976).

8 REFERENCES •

• • • • • •

• • • • •

Batista de Yee, G. y Connor J. Enero 1982. Estudios de las Algas colectadas en la Costa del Caribe de Panamá, su utilización y posible uso comercial. En Memorias, IV Simposio Latinoamericano de Acuicultura, Panamá. Asociación Latinoamericana de Acuicultura (Eds). Chapman, V. J. and Chapman, D. J. 1980. “Seaweeds and their Uses”. 3rd, Chapman and Hall: London. Chen, T. P. 1976. Aquaculture Practices in Taiwan. Fenical, W. 1982. Naturals Products Chemistry in the Marine Environment. Science 215: 913-928. Oliveira. E. C. 1981. Algas Marinas: Da exploracao aleatoriaz ao cultivo racional. Anais do II Congresso Brasileiro de Engenharia de Pesca. Oliveira, E. C and Kautsky, N. 1990. Cultivation of Seaweeds in Latin America. Universidad de Sao Paulo. Coordenatoria de Comunicacao Social. Organización de las Naciones Unidas para la agricultura y la Alimentación (FAO). 1993. Situación Actual de la Industria de Macroalgas Productoras de Ficocoloides en América Latina y el Caribe. Proyecto Aquila II, GCP/RLA/102/ITA. Piriz, M. L. 1993. Situación actual de los Carragenanos en América del Sur. Centro Nacional Patagónico, Argentina. Smith, A. 1986. A Guide to Seamoss Cultivation in the West Indies. Caribbean Conservations Associations. Smith, A. 1990. Annotated Bibliography of the seaweeds Uses for Food in the West Indies. OECS Fishery Report No 3: 76pp. Smith, A. 1997. Seamoss Cultivation in the West Indies. Caribbean Natural Resources Institute (CANARI). Guidelines Series 1. The Caribbean Moss Bulletin. 1996. A Newsletter for seaweed cultivation, products and uses. Issue No 6. Caribbean Natural Resource Institute (CANARI) (Eds).

1

SEAWEED RESOURCES OF PANAMA Chapter 4 FOOD AND MEDICAL USES OF MARINE ALGAE BY KUNA INDIANS ON THE CARIBBEAN, PANAMA GLORIA B. DE VEGA AND DALYS E. ALVEO University of Panama, Vice-President of Extension and Smithsonian Tropical Research Institute Roosevelt Ave. Building 401 , Tupper Balboa, Ancon Republica de Panama. P.O. BOX 2072 University of Panama, Estafeta Universitaria, Panamá. Ciudad universitaria Octavio Méndez Pereira. Web: www.up.ac.pa/

E-mail: [email protected]

INTRODUCTION The native Kunas of the San Blas Islands provide an example of the use of seaweeds as folk medicine. This study introduced a variety of local seaweeds used by the Kuna Indians for their own medicinal and cultural purpose. These plants were mainly used to treat social and physical illness of kuna women. Ethnobotanical investigations on the uses of the plants by various ethnic groups in Panama have largely ignored marine plants, although the uses of terrestrial plants are reasonably well documented (Nördenskiold 1938, Wassén 1969, Angermuller 1968, Cooke 1981, Prestan 1984). In the Republic of Panama at least two ethnic groups make use of seaweeds: the aboriginal kuna Indians and Negroes of African West Indian descent.

A BRIEF BACKGROUND OF THE KUNA INDIANS The Kuna people that presently reside in the Eastern Panama and in Northern Colombia have maintained a relatively high degree of cultural integrity despite four hundred years of contact with European whites and African West Indians. Since the Spanish Conquest, the kunas in Panama have divide into two principal groups: the mainland kuna in the mountains who have a non-marine ecology, and the kunas who migrated to the Caribbean coast and offshore to the San Blas Islands in 1850. Smith (1984) described kuna population by geographic and cultural features. There are four population by geographic location in Eastern of Panama and three in Northern Colombia. The present study area has the largest population. It is located on the San Blas Islands and adjacent coastal areas along Panama’s Caribbean coast. Cultural indicators point toward the unity of all kunas, but they also identify the rough boundaries between groups which are not in frequent contact.

2 The kunas traditionally collect mountain herbs for their own medicinal purposes. Bennet (1962) identified 12 terrestrial plants used as traditional medicinal herbs by Bayano Kunas on the mainland. All kuna populations share a common body of tradition which include ceremonial complexes and areas of cultural knowledge, such as herbal and medicinal knowledge, and spiritual knowledge (Smith, 1984). The different areas of specialised knowledge require specific talents or abilities and long periods of training. The disciplines are each named and specialists are given official titles when they master the disciplines (Smith, 1984). The kunas depend on medicine men called “inaduledi” to treat illness in kuna communities. To become an inaduledi, a kuna must be over forty years old and must study under the guidance of an older inaduledi to acquire knowledge of the plants used in herbal medicine. Medicine men participate in kuna medicinal treatments in four ways. A “senior” inaduledi is always a male therapy practitioner and is the only person permitted to treat the sick. A “nele” is a clairvoyant who can diagnose illness. The nele is usually a man but can also be a woman. A “sunmaket” is a nurse-practitioner who extracts the diagnosis from the nele by using a ritualistic chant in question and answer form. The discipline of medicinal knowledge, ina igala (ina = medicine), includes botanical pharmacology as well as repertoire of curing chants (Nördenskiold et al., 1938. Archibold 1973, Prestan 1976). In the kuna culture, most medicines are put in water that is subsequently used for bathing or drinking (Wassén 1969, Nördenskiold 1938). The nele then provides the diagnosis either from the answers to the questions or while in trance. A “nekapsoket” is a man who is called upon only during epidemics. The nekapsoket smokes a pipe and sings a chant of “magic words” to ward off epidemics from the community (Prestan 1984).

3

METHODS We visited Baltimore Island and Salorte Island in Bocas del Toro at the West end of Panama's Caribbean coast and the San Blas Islands at the east end of Panama's Caribbean coast (Map 1). With Roberto Lopez, a bilingual Kuna guide, we interviewed the inaduledi of four islands: Soledad Mandinga, Soledad Miriam, Narasgandup - dummat, and Waisala Tupo.

Map 1

RESULTS AND DISSCUSSIONS In the San Blas Islands, a kuna inaduledi explained how seaweeds are collected and stored in his pharmacy (Photo 21, 22). He identified species of green, red, and brown algae by kuna names and explained their medicinal uses. Species of Gracilaria, particularly G. Crassissima (Photo 12) sold to the pharmacies. These seaweeds were recognised by their characteristics cartilaginous texture. Kuna collected seaweeds from shallow intertidal reef areas, sorted and cleaned them, washed them in soapy water and rinsed them in freshwater before setting them in the sun to dry and bleach out. The clean, dried seaweeds were taken by boat to the city of Colon and distributed to pharmacies throughout Panama.

4

Photo 21

Photo 22

5 USE OF SEAWEED BY THE KUNA Seaweeds are mainly used to treat the social and psychological ailments of kuna women. Three methods are used: (a) fresh algae are soaked in fresh water that is used for bathing or to take a shower; (b) algae are dried and pulverised for storage and later rehydrated with cold freshwater and boiled as a tea; and (c) algae are dried and used as part of an ointment. Twenty one species of algae were identified by Judith Connor, a phycologist scientist from Monterey Bay Aquarium. She identified the algae species and the kuna names were given by the inaduledi. These included 7 species of Rhodophyta (Table 3), 9 species of Chlorophyta (Table 1), and 21 species of Phaeophyta (Table 2). Fourteen illnesses described by the inaduledi are treated with these algae. Seven illnesses were indicated by psychological symptoms and seven indicated by pain or by visible physical disorders (usually of the skin). The medicinal treatments must be accompanied by words or songs spoken or sung by the inaduledi. Any Kuna may gather algae but only the inaduledi knows the words to ensure their effectiveness. The medicines used by the Kuna usually involved herbs, as well as magic stones, animal bones, and pieces of wood. The active principle of the medicine is often “imitative”. For example, plants to counteract fever are collected from cool river places and curative property is imparted through contact (Archibold, 1973. Prestan 1976, 1984). However there have been no extensive studies on Kuna medicinal knowledge. Often folk illnesses have non-specific symptoms such as weakness, loss of appetite, depression, lethargy or laziness, or psychological symptoms of falling in love. In the kuna culture, some illness with psychological symptoms are given descriptive names such as the siren’s illness, the armadillo illness, stopping the menstrual period, starting the menstrual period, Satan inside yourself and Satan inside your home. The siren’s illness involves one of two classes of sirens: a good siren (a normal sardine) or a bad siren (a sardine with the face of a man and the body of a fish). If a pregnant woman sees a bad siren on the reef, it causes her to fall in love with a man who is not her husband. This illness is treated with fresh Gracilaria and Dictyota (Photos 12, 7). The inaduledi adds these algae to freshwater for the woman to bathe in. The armadillo illness is characterised by accelerated breathing. The name derives from an armadillo’s behaviour just before giving birth. The treatment is a mixture of dried Halimeda opuntia (Photo 13. File JPEG Food and Medical Uses of Marine Algae by Kuna) with epiphytes and coral boiled in a clay pot with freshwater and served as a hot tea. To stop a woman’s menstrual period, the inaduledi prepares a tea by boiling dried Acanthophora (Photo 1) to boiling water in a clay pot. Starting the menstrual period involves the preparation of a mixture of dry Caulerpa cupressoides (Photo 3) and Ernodesmis verticillata (Photo 8) in freshwater which is also served as a hot tea. Evil spirits or “Satan inside yourself” causes behavioural changes in the afflicted person. The medicine requires dried Penicilllus capitatus (Photo 18), Dictyosphaeria cavernosa (Photo 6) and Halimedia opuntia (Photo 13). These

6 algae which may have other algal epiphytes (“dibuibo”) or be without epiphytes (“disaki”) are boiled in a clay pot in fresh water. The sick kuna has to drink the tea while saying bad words against Satan to cast out the evil spirit. When Satan is inside a kuna home, the house is “out of order”. The inaduledi puts dry Halimeda tuna (Photo 14), Caulerpa sertularioides (Photo 5) and Caulerpa cupressoides (Photo 3) in water and boils them together. Each member of the home drinks this as a tea while singing bad words against Satan to cast out the evil spirit. If a person in this home faints and does not receive medicine, he will faint again and again throughout his life. The kuna have other groups of diseases that cause skin conditions or a general or specific pain, i.e., toothaches, and the diseases of the turtle, alligator, duck, and different hens. For toothaches, the inaduledi gives two types of treatment: (a) dried Gracilaria crassissima reconstituted as a hot tea; (b) Gracilaria crassissima (Photo 12) used as a compress on the tooth. The turtle illness causes the kuna to take on the appearance of a turtle, with protruding eyes and a deformed head with respect to body size. Dry Sargassum spp.(Photo 19) and Turbinaria turbinata (Photo 20) prepared as a hot tea serve as a cure. The alligator illness manifests itself by rough crusty skin and welts that resemble the texture of alligator skin. The kuna cure is to serve a tea made from dried Dictyota and Gelidiella acerosa (Photo 10). In the duck illness, the Kuna’s face resembles a duck with a large bill with boils or welts alongside the eyes. Two methods of treatment are used: (a) dried Caulerpa racemosa (Photo 4) is rehydrated with cold fresh water to make a hot tea; (b) Laurencia obtusa (Photo 15) is collected fresh and added to fresh water for bathing. There are several hen diseases in which the sick person’s skin takes on a color similar to that of a hen, i.e., yellow, red, white, and black, sometimes with black, red, or white hen disease the treatments are: (a): dried Laurencia obtusa is rehydrated to make a hot tea; and (b) Laurencia obtusa is collected and added to fresh water for bathing. The treatment for black hen disease are dry Padina prepared as a hot tea of bathing in fresh water with fresh Padina (Photo 17).

CONCLUSSIONS The use of seaweeds as supplements to herbs traditionally collected on the mainland probably represents a recent cultural adaptation to marine environment in the San Blas Island since 1850. Bennett (1962) noted that San Blas Kuna men appear to be taller and generally more robust than Bayano Kuna men and suggested that the physical differences might be ascribed to diet or healthier living conditions in San Blas.

7 Previous studies of herbal folk medicine have noted parallel uses of terrestrial plants by African West Indians and their Caribbean descendants (Angermuller 1968). In addition to the Panamanians interviewed, natives Barbados and Grenada reported use of algal colloids in milk-based beverages, but the medical values was not consistently recognised among those people interviewed (Judith Connor information). One interesting aspect of the folk taxonomy of seaweeds was classification of different species under one kuna name. For example, two morphologically dissimilar green algae, Penicillus capitatus and Dictyosphaeria cavernosa were called by one name, “mupate”. Two species of the same genus, Dictyota divaricata and D. volubilis were called the same name, “disamo”, and were grouped with the red alga Gelidiella acerosa, which had a similar golden brown color but quite a distinct morphology and texture. The common calcareous green alga, Halimedia opuntia was called “disaki” by itself, “dibuibo” when it was covered with other seaweed epiphytes, and “susiki” with both epiphytes and coral substratum attached.

REFERENCES • • •

• • • • •

•

Angermuller, L.A. 1968. Bush teas and folks remedies used by the West Indian population of Colon, Republic of Panama. Panamanian Notes 13:31 – 50. Archibold, G. 1973. La Medicina Kuna. Actasa del V Simposium Nacional de Antropología y Etnohistoria de Panamá, pp. 245 – 264. Panamá: Universidad de Panamá, Instituto Nacional de Cultura. Batista, G. and Connor J. December 1990. Native Uses of Seaweeds in the Republic of Panama. Annotated Bibliography of the Seaweeds used for food in the West Indies. OECS Fisheries Report No3.7-8. Caribbean Natural Resource Institute (CANARI) St. Lucia (Eds). Bennett, C. F. 1962. The Bayano Kuna Indians, Panama an ecological study of livelihood and diet. Ann. Assoc. Amer. Geographers 52 (1): 32 – 50. Cooke, R. G. 1981. Los hábitos alimentarios de los indígenas precolombinos de Panamá. Reimpreso de la Academia Panameña de Medicina y Cirugía 6 (1): 65 – 89. Nördenskiold, E. and R. Perez Kantule. 1938.An Historical an Enthological surveyof Kuna Indians. Comparative Ethnographical Studies 10: Göteborgs Museum, Ethnografiska Avdelingen Göteberg, Sweden. Prestan, A. 1976. La Enfermedad, la Curación y la Muerte en la Sociedad Kuna. Revista Nacional de Cultura 2: 39 – 44. Instituto Nacional de Cultura. República de Panamá. Smith, Sandra. 1984. Panpipes for Power, Panpipes for Play: The Social Management of Cultural expression in Kuna Society. Ph. D. Dissertation,Anthropology Department, University of California, Berkeley. 249 – 251. Wassen, Henry.1969. An Historical and Ethnological survey of the Kunas Indians. Comparative Ethnographical Studies 10: Göteborgs Museum, Ethnografiska Avdelingen Göteborg, Sweden.

8 Table 1 Clorophyta Scientific Name

Kuna Name

Chlorophyta Caulerpa cupressoides (West in Vah1) C. Agardh

ansukila

Photo 3

Caulerpa racemosa (Forsskal) J. Agardh

Muguse

Photo 4

Caulerpa sertularioides (S. G. Gmelin) Howe Photo 5

manikidu

Figure

9 Clorophyta Scientific Name

Kuna Name

Dictyosphaeria cavernosa (Forsskal) Borgesen

Mupate

Figure

Photo 6

Ernodesmis verticillata (Kutzing) Borgesen

morguelleguidu

Photo 8

Halimedia opuntia (Linnaeus) Lamouroux with epiphytes with epiphytes and cora

disaki

Photo 13

Susiki

Halimedia tuna (Ellis & Lamouroux

Timani

dibuibo

Solander)

Photo 14

Clorophyta

10

Scientific Name

Kuna Name

Neomeris annulata

Nonoligudu

Dickie Photo 16

Penicillus capitatus (Lamarck) Photo 18

Mupate

Figure

11 Table 2 Phaeophyta

Scientific Name

Kuna Name

Dictyota divaricata

Disamo

Figure

Lamouroux Photo 7

Dictyota volubilis

disamo NO GOOD PHOTO

Kutzing Vicers

Padina spp. Adansson Photo 17

Sensu

mudutu

12 Phaeophyta Scientific Name

Kuna Name

Sargassum spp.

mubarri

C. Agardh Photo 19

Turbinaria turbinata (Linnaeus) Kuntze Photo 20

muop

Figure

13 Table 3

Rhodophyta Scientific name

Gelidiella acerosa

Kuna name disamo

(Forsskal) J. Feldmann & Hamel Photo 10

Gracilaria cervicornis

canacua

(Turner) J. Agadh Photo 11

Gracilaria crassissima

canacua

P. et H. Crovan Photo 12

Laurencia obtusa (Hudson) Lamouroux Photo 15

disaki

Figure

1

SEAWEED RESOURCES OF PANAMA Chapter 5 SEAWEED FARMS ON THE CARIBBEAN COAST OF PANAMA GLORIA BATISTA DE VEGA1, CHRIS SHIELDS, RAUL YEE AND JOSÉ GONZÁLEZ2 1

- University of Panama and Smithsonian Tropical Research Institute - Gracilarias de Panama S.A. Techno Park of the City f Knowledge, Clayton, Panama. P. o Box 6-7483, Republic of Panama. 2

E-mail: [email protected] In Panama, cultivation activities of seaweed farms with Gracilaria and Eucheuma species, brought by the local people, started by Gracilaria de Panama S. A. with a research program in collaboration with of the University of Panama and Smithsonian Tropical Research Institute. Logistic support was received from Refinería de Panama, S. de R. L., ChevonTexaco Company, the University of California at Berkeley, the Municipality of Colon and local communities of the province of Colon. The mariculture activities, located on the North Entrance of the Panama Canal have advantageous position compared to other localities of the Caribbean Region. The existing infrastructure at the International ports will permit Panama to compete with the international market of seaweeds around the world (Batista, 1996). On the other hand, the fishermen trained in the cultivation of algae live close to the coastline. The modules are not deeper than 5 meters. The sites selected do not interfere with the passage of ships. This has been studied and confirmed by the Ports Engineering and Consultants Corp, to the Maritime Authority of Panama. The cultivation of seaweeds have been extended throughout the Caribbean region especially to the countries that were already executing marine biotechnology related activities. Argentina, Brazil, Cuba and Venezuela had been intented the exploitation of some native algae. (Bellorin and E. Oliveira, 2001). Most of the seaweed species that are cultivated by the West Indians are members of the gender Gracilaria with the exception of the specie of Eucheuma that is used in Antigua and Barbuda (Chapter 3 and 4). GOALS
To improve the socioeconomic level of local communities through controlled multiple use of the Caribbean coast.
To protect a unique coastal reef and mangrove forest ecosystem of the Caribbean Region to be managed in a sustainable manner.
To train fishermen on cultivation of algae.
To establish an International Coastal Center for the Caribbean Region that can integrate long term projects.

2 SOCIO ECONOMIC ANALYSIS. In the Republic of Panama at least two ethnic groups collect and consume seaweed, the Kuna Indians and the Afro-Antillean of West Indian Descent (Chapter 3 and 4). According to a survey executed in the area by Dr. John Cubit et al 1985, and Batista G., 1995, 36% of the population of the Province of Colon, depend direct or indirect of the seashore fishing. According to the "Contraloria de la Republica de Panama", the sites visited to interview contains a population, of 4,957 families (Table 1 File JPEG Seaweed Farms on the Caribbean Coast). These families sustain on activities related to the collection of algae combined with several types of fisheries. A total of 71.4 % of the people that collect algae prefer to collect them near the shoreline. They feel it is safer and convenient for the supervision, as the younger members of the family participate to a great extent in this activity. This high percentage tells us that there is a good potential of seaweed farmers in the area as these farms would allow them to stay close to the shores. The surveys also indicated that the amount of seaweed collectors has increased over the last few years: 45.8 % of the inhabitants says that marine algae are one of the three main sources of income before fish and shrimps about 64.5% of the population confirmed to be interested in seaweed farm activities. The main reasons were because it permits them to establish their own small business.

Table 1

3 45.7 % of 79 people interviewed, answered that they were interested in cultivating algae. They indicated that they could spend 1 to 4 hours daily on seamoss farming, while 28.4% indicated to have 4 to 8 hours free per day for this activity. 7.4% indicated to be able to work 8 to 12 hours and 16% would even be willing to spend more than 12 hours per day on this activity. These numbers in combination with the percentage of the total population indicate that almost half of the people in the area are interested in a part time 1 to 4 hours serving that could provide them an additional income (Figure 1).

We believe the two main reasons for these possible response are: 1 - The familiarity of the local people with coastline activities. 2- The high unemployment of the area approximately 30 %. SEAWEED FARMS ON THE CARIBBEAN SIDE Experimental seaweeds farms to export raw material of red algae: Gracilaria sp and Eucheuma Alvarezii (Doty) started in the year 2000 on the Caribbean Sea of Panama with Gracilarias de Panama S.A. This enterprise assumed the responsibility to develop a modern industry for the exportation of new products. Gracilarias de Panama has been implementing a system to improve the seeds and the diversification of the cultive with the collaboration of the Coastal Research Institute of Germany, GKSS in the analysis of the environmental parameters. Experimental project give us a strong relation between the environmental parameters and the quality of the final products. Recently the specie of Eucheuma spp that had

4 been observed as being two species of Eucheuma was identified by Joe Zucarelli as a Kappaphycus Alvarezii (Batista et al 2004 to be published). An experimental assessment of the potential for cultivation, with Kappaphycus alvarezii was established in 2002 by Gracilarias de Panama to investigate sustainable utilization of renewable resources and implications for marine and coastal zone management. It was demonstrated that a seaweed farm could produce raw material for commercial export, in addition to meeting the needs of local people and also providing a buffer zone and protection for the shoreline. We are currently following experimental harvesting over pre-selected periods, in order to determine carrageenan yield and quality characteristics. In particular, there are some interesting relationships between growth and molecular weight of the carrageenan produced which will be reported (Batista et al, 2004 to be published). DISCUSSION In Latin America, the mariculture of algae is in its beginnings however, the results obtained in Chile are really stimulating (Oliveira & Avel, 1990). In countries such as Argentina, Brazil, Cuba and Venezuela it has been intented the exploitation of some native algae (O. Valdés et al., 1993). There is also an strategic method: to import exotic species, apparently more adequated to mariculture than its local equivalents (A. Bellorin and Oliveira, 2001). A Seaweed Farm activity in Panama is one of an integrated coastal project part of the Sustainable Development Project at the Caribbean Entrance of the Panama Canal (Batista G, 1996). Through the cultivation of seaweed and the activities executed by the fishermen in the coastline on a day by day basis; they will have the opportunity to share experiences with the scientists within their environments. By reporting these changes the fishermen will include valuable information related to the development of the coastal region at the entrance of the Panama Canal. This could include information related to the changes observed in the amount of captured fish, the erosion of beaches of the islands and points around, the frequency and impacts of floods, the small but continuous changes of the sea levels and so on. Through this exchange of information there will be a better understanding of the importance of maintaining local communities and their socioeconomic activities on the coastal regions of the Caribbean side of the Republic of Panama. The environmental research executed by the Scientific Institutions and the fishermen might result in the identification for new suitable locations to extend the cultivation of algae and information related to new technologies in the cultivation of algae can be exchange with the Caribbean Region. An integrated management of the Caribbean coastlines must include the social, biological, and economic aspects as well as the dynamics of the Caribbean Sea. We must recognize and learn that all components of the ecosystem of the coastal region at the entrance of the Panama Canal are interrelated and must be studied together, but above all, must be managed together as an integrated plan for the Caribbean Region.

5 REFERENCES • • •

•

• •

Ports Engineering and consultants Corp. To: Panama Maritime Authority: PEC: 360-98. 13 de Julio de 1998. Bellorín, A. and Oliveira, E. 2001. Introducción de Especies Exóticas de Algas Marinas: Situación en América Latina. Sustentabilidad de la Biodiversidad. K. ALVEAL & T. ANTEZANA EDS. Universidad de Concepción, Chile. 693-701. Batista G. 1992. Food and Medical Uses of Marine Algae by Kuna Indians and the African West Indians on the Caribbean, Panama. pp. 44-82, In Submitted in partial satisfaction on requirements for the degree of Master of Science at The University of California, Berkeley, eds. Gracilaria Sea Farms on the Atlantic Coast of Panama in Connection with Establishment of a Nature Reserve with an Economic Purpose. Batista G. 1992. Survey of a feasibility of seaweed farming practice in Bahia la Minas Region, Colon, Panama. pp. 84 - 112, IN Submitted in partial satisfaction on requirements for the degree of Master of Science at The University of California, Berkeley, eds. Gracilaria Sea Farms on the Atlantic Coast of Panama in Connection with Establishment of a Nature Reserve with an Economic Purpose. Batista G.. 1995. Desarrollo Sostenible en Bahía Las Minas. pp. 9-13 IN Universidad de Panamá, Reflexiones Ambientales en el Área Interoceánica. Serie avance de Investigación # 6.Panamá. Batista, G. 1996. A sustainable Project at the Caribbean Entrance of the Panama Canal. Pp. International Symposium Bremen.

•

Batista Vega, G.; Trespoey, A.; Critchley, AT.; Bleicher Lhonneur, G.; Shields, C. and Lao, S. 2004. Cultivation of Red Algae Near the Caribbean Entrance of the Panama Canal and Optimization of Carrageenan Quality. To be published at XVIII International Seaweeds Symposium, Norway.

•

Cubit, J. D., G. Batista de Yee, A. Roman. And V. Batista. 1985. El valor de los manglares y arrecifes de coral en la costa de Colón. pp. 183-199. IN S. Heckadon Moreno and J. Espinosa Gonzales, eds. Agonía de la naturaleza. Importex, S.A. Panamá.

•

Oliveira, E.C., 1990. the rationale for seaweed cultivation in South America. In E.C. Oliveira & N. Kautsky (eds). Cultivation of Seaweeds in Latin America. Univ, S. Paulo, Brasil. P.135-141.

•

Valdés, O.; Cortés, R.; Araceres, A. and Díaz, M. 1993. Caracterizacion del Polisacarido producido por el Alga Roja Bryotamnion seafortii (Turner) Kutzing, procedente de un Banco Natural de la Costa Norte de la Plataforma Insular Cubana. Centro de Investigaciones Pesqueras e Instituto de Oceanología. La Habana, Cuba.

6

7

8

9

10

11

12

13

14

ACKNOWLEDGEMENTS From my Alma Mater the University of Panama I want to thank President Dr. Gustavo Garcia de Paredes, as well Vice-Presidents Dr. Ariosto Ardila and Dr. Betty Ann Rowe de Catsambanis for their permanent support of my innovative concepts and Professor Cristina Garibaldi and Dr. Alfredo Soler for the collaboration of the laboratory facilities. Dr. Ira Rubinoff and Dr. Stanley Heckadon from the Smithsonian Tropical Research Institute that have been a permanent source of inspiration for me to continue in the rewarding work of scientific research. Our sincere expressions of gratitude to the persons who have inspired and guided our work through the years. Dr. John West, University of Australia, Dr. Arnold Schultz and Dr. Wayne Sousa, from the University of California at Berkeley. The authors would like to thank the SeaWiFS Project (Code 970.2) and the Distributed Active Archive Center (Code 970.2) at the Goddard Space Flight Center, Greenbelt, MD. 20771, for the production and distribution of these data, respectively. These activities are sponsored by NASA´s "Mission to Planet Earth Program". The authors give special thanks for the technical and logistic support offered to the project by Dr. Hans Von Storch (Director of Coastal Research GKSS); Dr. Wolfgang Rosenthal (Head of Department of Combined Models GKSS) and Adolfo Contreras (Ph D. student) for their invaluable help in this research work. The authors would like to thank the Coast Watch Caribbean Regional Node NOAA/OML Remote Sensing Group, for the production and distribution the AVHRR (Advance Very High Resolution Radiometer) data. I am greatly thankful to my friends Dr. Judith Connor, Monterrey Aquarium and Dr. John Cubit from the NOA for believing in my dream of sustainable development of the Caribbean coast of Panama. I must stress the permanent support I have received from personal of ChevronTexaco Company in the United States as well as in Panama, Georgia Calahan, Gordon Smith, Rafael Jaen, Herman Santos have been outstanding in their commitment toward a sustainable development. Special tribute must be given to Randy Barnner, Hector Gondola fishermen that have been initiated in the seaweed farm activity with us, and the Kuna community of women of Cativa who taught us the seedline planting. The invaluable assistance of Mr. Carlos Urriola, General Manager of Manzanillo International Transportation (MIT) and Mrs. Nilda Quijano, Director of Department of Human Resource of MIT. They donated must of their time, to give us the logistic support in the exportation process.

15 MESSAGES FROM LEADERS OF THE REPUBLIC OF PANAMA COMPROMISED WITH THE WELL BEING OF THE COASTAL ZONE Messages from the persons whose contribution to the realization of the seaweed farm in Panama has been outstanding. Their words of encouragement give us hopes for the future of this project. Dr. Gustavo García de Paredes President University of Panama Ciudad Universitaria Octavio Méndez Pereira. •

It is with pleasure that I introduce the topic “Seaweed Resources of Panama” as a contribution to the project “Seaweed Resources of the World.” We live in an age that is fully aware of the need to deliver scientific knowledge based on through research aided by state-of-the-art technologies that enable a more amplified perspective of how things exist, are created and co-inhabitants and how they can become useful to mankind. More and more, a wide spectrum community not only interested in specific knowledge, but also on how facts and inquiries on our environments can be inserted a much more “global” knowledge of science in demanding practical results to safeguard our Natural Patrimony. We live a scientific age that no longer belongs to scientists isolated in university laboratories. Science has become a “living” material, an object and a subject in itself. It is up to scientists to promote a better understanding of our surroundings by sharing and integrating our common interests in order to build a more knowledgeable world. Prof. Gloria Batista de Vega’s contribution to the Expert Center for Taxonomic Identification of the University of Amsterdam focuses on the development and exploitation of the different types of seaweeds abundant in our Panamanian coastal zones. An in-depth study has been conduced to determine their environment and the forces “in situ” affecting their growth, development and exploitation. To maximize their exploitation as a natural resource a number of strategies could be developed from this research. It provides scientists concerned in this area with invaluable information of the Panamanian ecological system in which seaweed prosper. It is a step forward to keeping alive the sincere interest to coordinate efforts for the worldwide protection and exploitation of the seaweed as a natural resource.

16 Engineer Rafael Jaen W. Super-Intendent, Refinería Panamá S. de R.L. ChevronTevaco Company. The human race is strongly in need of enhancement of the quality of life. We have the intellect and the necessary passion to get there, but for that purpose we need sustainable development in its various forms. The world needs the contribution of all people can make a difference. From a responsible perspective, all social-technical settings must embark in this endeavor with a solid principle: “to conduct business in a socially responsible and ethical manner that protects safety, health and the environment”. The industry needs to make sure it is creating superior values for everyone through environmentally sound operations and supporting wise and transcendental initiatives such as the one that is being led by Dr. Gloria Batista on the field of seaweed in Panama. It is evident that when the intellect is put to serve the world we will surely achieve the goal of creating a better habitat for the human race. Dr. Stanley Heckadon Moreno Advisor to the Director, Technological Transfer and Environmental policy, Coordinator of Galeta Marine Laboratories and Scientific Staff Smithsonian Tropical Research Institute (STRI) •

A note on Galeta Point Marine Laboratory. Since 1960 the Smithsonian Tropical Research Institute better known for its acronym of STRI, has operated the Galeta Point Marine Laboratory on the Caribbean entrance to the Panama Canal. The presence of STRI in the isthmus harks back to the great expedition the Biological Survey of Panama during the construction of the interocenic canal (1910-1912). Research at Galeta has concentrated on three main tropical coastal and marine ecosystems: coral reefs, sea grasses and mangroves. All three ecosystems are threatened by a destructive style of economic development. Over three hundred scientific publications a test to the productivity of this field station. STRI also carries out, since 1972, a marine environmental monitoring program measuring a host of climatic and oceanographic variables. This very extensive and important mass of information can be accessed via the internet. Starting in 2000 a marine environmental education program has been started to help build bridges between the scientific research and the educational system in Panama. Galeta now receives some 5000 students yearly, in large measure thanks to the interest of the business community. A well informed citizenry is essential to the task of protecting natural resources in our planet.

17 It is with outmost satisfaction that we welcome the publication of this book on marine plants and congratulate Gloria Batista for her dedication to expand our knowledge about these species and for her dedicated commitment to protect the environment and improve the lively hood of coastal communities. Engineer Carlos Urriola General Manager Manzanillo International Terminal-Panama, S.A. •

Approximately 60% of the world’s population lives within the coastal zone and coastal areas, which are increasingly subjected to a variety of uses and demands. Panama is no exception and many of its coastal ecosystems are subject to pressure from urbanization, recreation, agriculture, industrial and port activities. The last one is the case of Manzanillo International Terminal-Panama (MIT). MIT, located on the Atlantic entrance of the Panama Canal, provides secure and efficient port services to the shipping lines transiting through the Panama Canal or serving the Central, South America and the Caribbean Regions. While the port allows shippers and consignees to get on time mobilization of their cargo to any of its final destination, MIT monitors and manages each facet of its relationship to coastal zones for the habitats and species conservation, such as the seaweed. We invite you to know more about the Panamanian coastal biodiversity in the chapter titled: "Seaweed Resources of Panama" and to discover the beauty of our natural patrimony. Dr. Wolfgang Rosenthal Director GKSS, Coastal Research Institute •

The development of our coast accelerates within the last years and the public opinion grows that there is a need for a sustainable management of the coastal environment. The integration of sensible ecological systems that indicate the water quality are especially important. Therefore the development of seaweed resources is a beautiful example for developing a water quality indicator and at the same moment participate in industrial production and in the management of coastal parameters. It seems especially worthwhile that the seaweed farms are being built in areas where we have industrial use like in harbour entrances or near to electrical power plants. In the cooperation between different users and the understanding of the mutual and sometimes conflicting interests we can come to an acceptable coexistence that guarantees the existence of high life quality also for the coming generations.

PRELIMINARY ANALYSIS OF THE IMPACT OF CULTIVATION CONDITIONS ON CARRAGEENAN YIELD AND QUALITY FROM A NEWLY ESTABLISHED FARMING AREA IN PANAMA. TRESPOEY, A.1, DAESSLE, J.2, BATISTA, G.3, BLEICHER-LHONNEUR, G.1, CRITCHLEY A.T.1. 1

Degussa Food Ingredients SAS, Baupte, 50500, France. / 2ENSBANA, Dijon, 21000, France. / 3University of Panama and Smithsonian Tropical Research Institute, Panama. Introduction. Seaweed is mainly sold by weight, so the interest, for farmers, is to maximise the growth of seaweed or the production of biomass as a function of the seaweed selection and physical conditions at the farm site (e.g. salinity, temperature, current, light or depth). These parameters are site specific, the weather itself cannot be modified, but an appropriate site can be selected, according to the climatic data, quality of water, planting methods or duration of the cultivation period. In contrast, the producer of colloids seeks a constant quality of raw material and then an optimised and ideally predictable purity and quantity of colloid extract (e.g. molecular weight, non kappa fraction and Yield). In 1995, an experimental seaweed farm, for the cultivation of seaweed as a raw material and carrageenan production, was established on the Caribbean coast of Panama, in an area around the District of Colon, at the North entrance of the Panama Canal (Figure 1).

Figure 1: Geographic location the culture area in Panama (Courtesy Gracilarias de Panama). A: map, B: aerial picture of Panama Canal, C: aerial picture of region around the canal.

1

This area is one of the most monitored tropical coastal zones. Indeed data has been collected since the early 1900´s. In 2000, the Coastal Research Institute of GKSS installed a high tech monitoring system to integrate environmental data at the site. The objective was to investigate sustainable and commercial sources of seaweed raw material as well as implications for marine and coastal zone management. Consequently, Kappaphycus alvarezii cultivation was established in 2002 for an experimental period of five years. The first phase ended in October 2003. This study investigates the optimisation of the production of seaweed as well as the quality of the carrageenan obtained, at the Colon seaweed site, Panama and presents an analysis of experimental data, collected in 2003. Review of environmental factors It would be dangerous to only take into account environmental factors in the selection and establishment of a site for the production of seaweed. Just as for the culture of the vine, it is essential to introduce the concept of "terroir" into the case of algoculture. This concept includes the interaction between groups of factors (e.g. environmental, socio-economic and technical). It is the conjunction of these three factors which confers individual and sometimes a unique condition on local production. This determines the characteristics which differentiate one production site from another – and contributes to the « terroir » notion. This is why not all newly established farming areas are successful. Generally seaweed farmers are often economically disadvantaged . Sometimes, the seaweeds might grow well locally « the right seaweeds in the right place » - but the social conditions mean that people might not be attracted to seaweed farming activities. Conversely, in some areas, the local environmental conditions are not suited to produce high quality seaweed - « the right seaweed in the wrong place » - and poor people can live only on a subsistence level. The best situation is where environmental conditions are good and seaweed cultivation provides a positive benefit to local employment opportunities. It should always be remembered that seaweed production centres can change according to the social, environmental and, or political circumstances of instability in these regions of production. However, in this report we will apply ourselves to the impact of environmental factors on the production of Kappaphycus in Panama. Contrary to terrestrial plants which satisfy their needs from the ground and the air, water is the single source of nutrients for the seaweed. Salinity (i.e. quantity of salts dissolved per quantity of sea water) is to the algae what the mineral composition of the soil is for plants. But few minerals measured during the culture records. Natural salinity varies 100/00 in the Baltic with 400/00 in the Red Sea. The growth of Kappaphycus is favoured when salinity is about 32 to 350/00 and it is inhibited below 280/00 (De Paula, 2001). However, the specific measurement of salinity is not sufficient, it is also necessary to take into account the variability of this parameter due to the possible arrival of large quantities of fresh water (i.e. rain at the mouth of a river). Tests carried out in Hawaii (Glenn, 1990) , showed that at a nitrogen concentration of 2-4 µg-atm/L and a phosphate concentration of 0.5-1µg-atm/L, the relative growth rate of Kappaphycus alvarezii was approximately 5% per day. The pH is also a frequently measured parameter. As it was generally stable (i.e. pH 8-8.2) it did not appear to influence growth in this study. It is reported that Kappaphycus alvarezii seems to grow in a range from pH 7-9. Light is essential for photosynthesis and therefore growth. Kappaphycus transforms light into chemical energy necessary for the synthesis of organic matter. The quantity of light (i.e. sun and weather changes) and its transport (i.e. clarity of water, depth and density of the cultivation) and also the presence of chlorophyll influence photosynthesis. The measurement of irradiance (within the photosynthetically active range – PAR - mol of photons/ m²/ s) is an indicator of the 2

light suitable for photosynthesis. The depth of the cultivation also influences the quantity of energy available to the seaweed for growth. However, if the culture is held too close to the surface, the radiation may inhibit photosynthesis and also growth of the seaweed. Conversely, if the seaweeds are positioned too deep, optimal growth cannot be achieved. Similarly the density at which seedlings are suspended along the line also influences the penetration of light and can affect growth. Temperature is an important parameter for the growth of Kappaphycus ( see table 1). In fact, the distribution of seawater isotherms determines the possible geographical areas suitable for cultivation (i.e. roughly between the tropics of Cancer and Capricorn). Temperature range Impact on seaweed Below 18-20°C Between 20-25°C Between 20-25°C Between 20-25°C Above 35°C

Death of seaweed Acclimatisation of seaweed Optimal growth of seaweed Acclimatisation of seaweed and decrease of photosynthesis activity Inhibition of growth and death of seaweed

Table 1: Impact of temperature on the seaweed (Kappaphycus alvarezii), according to Glenn (1990).

The overall importance of temperature on geographic distribution of seaweed farming activities is not surprising since it has a major influence on the activity of enzymatic systems (i.e. photosynthesis and also carrageenan biosynthesis). Water movement is an essential factor influencing seaweed growth and development. Initially the lunar cycles influence the intensity of the tides, which are themselves influenced by marine winds and currents. None of these parameters can be controlled. Marine currents vary under the influence of the temperature of water and also winds. They can be modified by the presence of natural obstacles. Water motion homogenises the availability of nutrients and dissolved gases (i.e. sodium, phosphate, nitrogen and dissolved carbon dioxide) within the sea. At the same time the currents also remove wastes from the cultivated seaweed. For Kappaphycus alvarezii (Figure 2), Glenn and Doty (1992) showed a linear increase in growth at water current speeds between 5-15cm/s. FAO recommend water current speeds of approximately 20cm/s. However, if the seawater is low in nutrients, a higher speed (i.e. 30cm/s) can allow sufficient exchange of nutriments and gases. Conversely currents of approximately 10cm/s are sufficient to ensure adequate growth of seaweeds, in nutrient rich conditions.

Figure 2: Kappaphycus alvarezii (Courtesy Dr. I. C. Neish). 3

The influence of the current speed on growth is known but its evaluation is arduous because the speeds vary considerably on a same area, in a short time. An average value of marine currents does not show the real distribution of the current forces. Therefore it is very difficult to correlate this parameter with growth. Water movement effects can be modified by the attachment methods of plants on the rope (Figure 3). Glenn and Doty (1992) showed an influence of attachment on growth as a function of current speed. The more secure the seaweed is attached, the better is its growth.

Figure 3: Attachment methods of Kappaphycus alvarezii (Courtesy Dr. I. C. Neish).

The environmental factors are interdependent. The schema (Figure 4) shows the relationships between these factors.

Lunar cycle

Wind

Cultivation parameters Tide

(density Water movement Pollution

(depth)

Light

Water quality (clarity of water)

Season

(rain)

Temperature of Water

Geographical area

4

The iota fraction is a particular parameter which is representative of the maturation of the seaweed thallus during growth and also carrageenan quality (Zablackis et al., 1991). Thus the older tissues contain kappa. Kappa carrageenan makes a strong gel so as to make rigid the wall in function of the growth and to maintain the alga in a medium of wave exposure. On the other hand, the new tissues contain primarily iota and precursors allowing an easier elongation of the branching. However, the distribution of the various types of carrageenan is not entirely clear. It must, moreover take account of the ionic exchanges between the alga and its surrounding seawater medium. It is to satisfy these exchanges that more sulphated compounds (i.e. iota carrageenan) are found near the epidermis (Lechat, 1998).

Materials and Methods. Description of the area. The seaweed cultivation project was organised into 14 farms called “polygons” by the Maritime Authority of Panama (AMP). The experiments were conducted at three farm sites located at the North of Largo Remo Island, called Site 1, 2 and 3. The three sites were in a lagoon, opening to the sea and surrounded by mangroves. The annual weather pattern of this area is locally described as having a “dry season” (e.g. November-March) a variable “little dry season” (eg. March-May) and a “wet season” (e.g. May to July). The little dry season was similar to the dry season but sporadically interrupted the rainy season, usually between July and October. Turbidity of the water and wave action increased during the dry season but there was little change to seawater temperature (approximately 29°C) and salinity (33 0/00). During these periods, a number of environmental variables (13) were recorded directly at the sites of cultivation (i.e. Water : turbidity, pH, salinity, conductivity, speed of the current, temperature (at the surface and a depth of 30cm) and others: temperature of the air, exposure to the sun, light intensity, depth of cultivation, speed of the wind). Description of cultivation. The experimental cultivation material was Kappaphycus alvarezii (also known as “cottonii” and Eucheuma cottonii). Seedlings required to start the cultivation originally came from Venezuela and before this from The Philippines. Multiplication of the material for cultivation was carried out by vegetative means (e.g. production of cuttings or seedlings). No sexual reproduction was observed. The normal or natural cycle of reproduction of many algae normally offers two possibilities of multiplication: sexual (by fusion of gametes and production of spores) or vegetative (asexual multiplication). It may be the case at when seaweed is placed in a situation, which favours rapid growth, they may use vegetative reproduction since it consumes less energy and is completed more quickly. In this way, some seaweeds may loose their ability to reproduce sexually – this may be the case in K. alvarezii. It is suggested that possibly, the loss of reproductive ability by the seaweed is due to stabilisation and some selective control of the environment, which is modified by Man (in the form of the cultivation beds). The seedlings (generally approximately 100g and called propagules) are produced by cutting fragments from the thallus of selected plants collected during the 5

preceding seaweed harvest. The plants are selected on the basis of their generally healthy appearance, ability to grow at the site and colour. Empirical selection was made for the most healthy and productive thalli. After sowing at the site, the algae were allowed to develop for several weeks. Then the fully grown plants (weighing several kg) were collected and dried (Figure 5). Selected plants were again used for the production of new seedlings and the next sowing of the following crop.

Figure 5: Drying methods of Kappaphycus alvarezii use in Panama (Courtesy Gracilarias de Panama).

Different cultivation techniques exist (Figure 6). Monoline or fixed off bottom method is the easiest and frequently adopted in a number of places in the world since it is inexpensive, easy to set up and does not require much maintenance. Floating short-line or long-line systems have found favour especially where seaweed is grown in deep water. It is the most environmentally friendly technique but requires the farmers to possess a small boat for access and harvest. The floating structures used in Panama are modified from the fixed off bottom system and seem more closely related to a long-line floating method (Figure 7). A module is rectangular in form (Figure 8) and built with 5 nylon lines (5m length) spaced at 50cm intervals which are attached to mangrove sticks (2m length). Each rope seeded with algae is oriented horizontally in the water suspended just below the surface. The module, also called a replica, is anchored by fixing each of the mangrove sticks to the sea floor using an anchor rope (2-meter length) embedded into the seabed. A soda bottle is attached to each end of the stick to provide floatation of the ropes. A succession of 3 modules composes a raft. Two sowing methods were applied: 21 seedlings per rope (method 1) and 11 seedlings per rope (method 2). In order to evaluate the impact of season on the culture of Kappaphycus alvarezii, the cultures were repeated 4 times, i.e. there were 4 cycles of propagation by cuttings. The experiments ran from November 14, 2002 to July 31, 2003 as follows in table 2. A very important factor to be taken into consideration was the duration of cultivation (i.e. the amount of time the seedlings were allowed to develop before being harvested). Therefore in this study, several duration of cultivation grow-out time were studied during each phase or experiment. 6

Monoline or fixed off bottom method

Long line floating method

Figure 6: Systems of culture known as monoline and long line (Courtesy Dr. I. C. Neish).

Figure 7: Photographies of the experimental farms (Courtesy Gracilarias de Panama).

Figure 8: Drawing of the module, Panama.

7

Experiment

Date of cultivation

Type of season

Experiment I

04 November 2002 – 09 January 2003

dry season

Experiment II

22 January 2003 – 17 March 2003

dry season

Experiment III

18 March 2003 – 19 May 2003

little dry season

Experiment IV

20 May 2003 – 31 July 2003

wet season

Table 2: Details of experiments carried out Panama.

Determination of the growth. Many methods of expression of growth are given in the literature. Two of them were chosen (i.e. the most frequently given) so as to be able to compare the obtained values with those (De Paula, 2002) obtained in other regions of Kappaphycus cultivation (e.g. Philippines, Venezuela, Hawaii, China). These equations of the relative growth rate (RGR) were:

(1)

(2)

& final wet weight # 100 'ln$ ! / number of cultivated days % initial wet weight "

1 & # number of cultivated days final wet weight , ) 100 - $* - 1! ' $+ initial wet weight ( ! % "

Carrageenan analyses. Carrageenans are sulphated polysaccharides extracted from selected members of the Rhodophyceae. These polymers comprise units of D-galactose alternatively α (1→3) and β (1→4) linked and principally differentiated by the number and position of sulphated groups and the presence of a 3,6 anhydro-galactose bridge. They are identified by 15 idealised structures, each form possessing different rheological properties (e.g. kappa: breaking, iota: elastic and lambda: viscosifying). Some precursor forms, which do not contain anhydro- galactose, exist in seaweed (e.g. µ for kappa). These precursor forms can be transformed to anhydro-galactose by enzymatic or alkali action with high temperature treatment (in the extraction process). The kappa form of carrageenan extracted from Kappaphycus alvarezii was investigated in this study. Carrageenan which is extracted from the raw material without depolymerisation is referred to as “native carrageenan”. It is produced by digestion of the raw material which involves maceration of the alga in water at 60°C (thereby reducing the volume by 95%), with mechanical agitation (turbotest, Rayneri) for 4hours. After maceration the solution is filtered (Büchner – bolting cloth). Potassium chloride is added to the filtrate (0.5% w/vfiltrate, Prolabo) and a precipitate of carrageenan is produced with 2–propanol alcohol (80%) and washed twice with alcohol. The coagulate is dried in a ventilated room at 60°C for 16 hours. The average molecular weight of the carrageenan is regarded as a good quality parameter. Molecular weight is determined after Lecacheux et al. (1989) by size exclusion chromatography (GPC). 8

As carrageenans are film forming, non kappa fraction (iota and precursors) is identified by an infra-red method. The ratio of the slope value for two lines established using peaks of transmittance (i.e. 930nm, 845nm and 805nm wavelengths) are used to determine the proportion of iota or precursor carrageenans. Yield is calculated according to the dry weight of the seaweed material extracted. Statistical analysis. Data were tested for normality and homogeneity of variance using StatGraphics Plus 5.1. An ANOVA analysis was performed to determine the coefficient of correlation (P