Die neuen mikrobiologischen Verfahren der TrinkwV - Erfahrungen

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E. coli. ISO 9308-1. ▫ coliforme Bakterien. ISO 9308-1. ▫ Enterokokken. ISO 7899-2. ▫ Clostridium perfringens. TrinkwV2001. ▫ Koloniezahlen. EN ISO 6222.
Trinkwasserverordnung 2001 Die neuen mikrobiologischen Verfahren der TrinkwV – Erfahrungen – Interpretation der Ergebnisse Ernst-August Heinemeyer Niedersächsisches Landesgesundheitsamt Außenstelle Aurich

Neue Normen quantitative Trinkwassermikrobiologie „ „ „ „ „ „ „

E. coli ISO 9308-1 coliforme Bakterien ISO 9308-1 Enterokokken ISO 7899-2 Clostridium perfringens TrinkwV2001 Koloniezahlen EN ISO 6222 Koloniezahlen Anl. 1 Nr. 5 AF Pseudomonas aeruginosa EN ISO 12780

Untersuchungsdauer TrinkwV-1990 / TrinkwV2001 Parameter

Untersuchungsdauer in Tagen TrinkwV1990 neg. positive Probe 2 4-5 2 4-5

E. coli coliforme Bakterien - altern. Verfahren Colilert Koloniezahlen 20°C/22°C 2 Koloniezahlen 36 °C 2 Enterokokken 2 Clostridium perfringens 2 Pseudomonas aeruginosa 2

2 2 3 4 4

TrinkwV2001 neg. positive Probe 1 2-3 1 2–3 1 1 3 3 2 2 2 2 1 1 *) 1 2-3 (ggf.länger)

*) bei Verwendung des mCP Agars; die Verwendung des TSC Agars erfordert weitere Subkulturen, die die Untersuchung auf etwa 2-3 verlängern.

Koloniezahlen Koloniezahlen Koloniezahlen

EN ISO 6222 Anl. 1 Nr. 5 AF

Vergleich der Koloniezahlbestimmungsmethoden: alte und neue Trinkwasserverordnung Methode

Test 1 (n=50) m ± s [KBE/ml]

Test 2 (n=100) m ± s [KBE/ml]

TrinkwV 20°C, 2 d +Lupe EN-ISO 22°C, 3 d - Lupe TrinkwV 36°C, 2 d + Lupe EN-ISO 36°C, 2 d - Lupe

14,3 ± 6,6 101,9 ± 61,9 8,2 ± 3,9 17,9 ± 14,8

5,0 ± 9,3 ± 1,8 ± 2,4 ±

2,5 4,4 1,7 2,1

(Mittelwerte und Standardabweichung von 10 Laboratorien der AWWR, n. Tuschewitzky)

Koloniezahlen EN ISO 6222 und TrinkwV-90 im Vergleich (Ringversuch 1/2003)

20 °C-AF

22 °C-NF

36 °C-AF

36 °C-NF

Anzahl

157

68

155

67

Mittelwert

20,7

21,1

21,0

20,6

Median

21

21

21

20

KBE bei 20 °C und 36 °C (XY-Diagramm; RV 3/2002) 80

KBE / ml bei 20 °C

70

60

50

40

30

20 20

30

40

50 KBE / ml bei 36 °C

60

70

80

KBE – Fehlerquellen „ „ „ „ „ „ „ „ „

das Ablesen der KBE erfolgt ohne (korrekte) Lupe die Gießtemperatur des Agars ist zu hoch die Gießtemperatur des Agars ist zu gering (Klumpenbildung) Die Nährbodenqualität ist ungleichmäßig falsche Zusammensetzung des Nährbodens (Eigenrezepturen) keine Verwendung kalibrierter Pipetten ungenügendes Schütteln der Probenflasche vor dem Pipettieren falsche Bebrütungstemperaturen Stapelhöhe der Agarplatten

E. coli

ISO 9308-1

coliforme Bakterien

ISO 9308-1

Nachweis von E. coli / coliformen Bakterien ISO 9308-1 (Lactose TTC Agar) coliforme Bakterien (Laktose-Vergärung)

Bromthymolblau

Bromthymolblau

(blau bei pH 7,6)

(gelb bei pH 6,0)

Säurebildung

Hemmung der gram positiven Begleitflora durch: Tergitol-7 (Natriumheptadecylsulfat) u. TTC (Triphenyltetrazoliumchlorid)

TTC Ringversuchsprobe I/2003

Laktose-positive Kolonien auf TTC Agar E. coli / coliforme Bakt. (TTC Agar, RV 2/02) Mittelwert und Standardabweichungen sind zufallsverteilt aus 20 Teilnehmerergebnissen berechnet Gruppe A 80

60

50

40

30

20

10

0 1 2 3 4 5 6 11 12 14 16 17 20 21 25 26 27 28 31 36 38 39 42 44 46 53 55 56 58 60 101 102 110 113 117 119 126 127 128 131 140 141 150 154 155 156 161 162 165 170 171 175 176 178 180 182 198 200 206 208 212 218 218 219 221 228 229 232 233 236 237 243

n E. coli + colif. Bakt. / 100 ml

70

NLGA AS Aurich Z RV 2/2002

Labor ID Nr Abb. 3 X-3S

X-2S

X-quer

X+2S

X+3S

[n] Laktose+ Kolonien

TTC „negative Kultur“

E. coli / coliforme Bakterien „ „ „

EN ISO 9308-1 8.3 Inkubation und Differenzierung Anmerkung 1: Eine Verlängerung der Inkubationszeit auf (44 ± 4) h kann eine erhöhte Sensitivität des Testes zur Folge haben und kann besonders für solche Platten nützlich sein, die nach (21 ± 3) h keine typischen Kolonien aufweisen.

TTC Oberseite

TTC Unterseite

Trinkwasserprobenbearbeitung im Vergleich vor- und nach der Umstellung der Bebrütungsdauer (im Januar wurden 44 h, im März nur noch 21 h bei 36 °C bebrütet)

Testmonat

Untersuchungen Trinkwasserproben

verdächtig davon positiv nach 24 / 44 h

Januar 2003 März 2003

144 150

32 6

*) davon 4 Proben aus einer Untersuchungsserie

6 *) 1

Testprinzip Colilert Nachweis je eines spezifischen Enzyms Coliforme Keime: β-Galactosidase Laktose + H2O → Glukose + Galaktose

E. coli: zusätzlich β-Glucuronidase Dauer: bei positivem Ergebnis 19 ± 1 h (grenzwertig bis 22 h)

TTC-Agar - Colilert (lactose + Kolonien/MPN-Zahlen)

50 20

30

40

ab hier Colilert

colilert

0

10

[n] lactose-positive Kolonien

60

70

Mittelwert und Standardabweichungen sind zufallsverteilt aus 20 Teilnehmerergebnissen berechnet

NLGA AS Aurich RV 1 / 2003

Labor ID Nr X-3S

X-2S

X-quer

X+2S

X+3S

lac-positive Kolonien

Klebsiella pneumoniae

Serratia marcescens

Was sind eigentlich Coliforme Bakterien ?

Laktose + Gasbildung

Laktose + / Gasbildung

ß-Galaktosidase

Coliforme Bakterien nach Trinkw-1990 Coliforme Bakterien nach Trinkw-2001- ISO 9308-1 Coliforme Bakterien nach Trinkw-2001- alternatives Verfahren (Colilert)

Laktoseabbau und ß-Galaktosidase Farmer (Manual Clin. Microb. 1995)

von 121 Enterobakterien - Species „

„

bauen 38 Spezies zu ≥ 50 % Laktose zu Säure (± Gas) ab besitzen 80 Spezies zu ≥ 50 % eine ßGalactosidase

Enterokokken ISO 7899-2

Nachweis von Enterokokken (ISO 7899-2) A Filtration + Inkubation auf Membranfilteragar nach Slanetz & Bartley 2,3,5 Triphenyltetrazoliumchlorid (farblos)

Enterokokken

Formazan (rot)

Selektiv wirkt Na-Azid

B Bebrütung des Filters auf Galle-Äsculin-Azid Agar (Bestätigungstest) Enterokokken bei 44 °C

1) Äsculin

6,7 Dihydroxy-Cumarin + Glucose

2) 6,7 Dihydroxy-Cumarin + Fe+++

braun-schwarze Verbindung

Enterokokken auf Galle-Azid-Eskulin-Agar

0 458 003 026 431 182 477 180 371 392 387 420 401 437 350 479 460 473 004 237 450 439 377 141 013 236 475 233 281 419 427 218 358 385 005 156 042 332 250 421 219 056 208 354 162 206 328 435 467 459 412 060 440 297 415 340 389 391 263 355 405 384 312 027 155 244 229 102 038 293 344 256 329 021 380 025 309 150 331 006 165 168 321 232 395 311 058 283 485 360 178 373 113 016 161 046 212 243 367 438 127 221 002 110 170 171 198 012 284 205 318 154 055 457 265 119 036 176 126 017 011 039 001 131 175 305 044 128 363 200 028 117 140 247 472 031 014 020 101 277 228 279 285

[n] Enterokokken / Vol-Einheit

Enterokokken Filtration und Plattengussverfahren im Vergleich

50

40

30

20

10

NLGA AS Aurich Z RV 2 / 2002

KBE 1 ml Original EK 50 ml Filtrat entspr. 1 ml Original Abb. 5

Enterokokken RV 2/2002 Methode KBE / 1ml ISO 7899-2 Sollbereich

berücksichtigte Ergebnisse 140 138

Mittelwert 17,8 14,6

2,9 – 55,3 Enterokokken / 100 ml

Wiederfindungsrate nach ISO 7899-2 gegenüber dem Koloniezahl-Agar beträgt damit: WFR = 14,6 * 100 % / 17,8 WFR = 82 %

Clostridium perfringens „

in Koloniezahlagar

„

nach Filtration auf

mCP-Agar (TrinkwV-2001)

„

nach Filtration auf

TSC-Agar (ISO 6461-2)

(Dank an Fa. Sifin/Heipha & Oxoid)

0 039 293 458 027 141 256 003 284 421 431 212 212 420 312 154 219 026 208 127 228 344 265 412 126 016 206 013 473 038 200 479 058 263 004 384 387 401 156 011 155 385 036 101 477 060 198 485 331 180 354 178 244 438 110 415 309 281 419 014 389 340 229 305 243 243 391 373 168 247 457 021 140 439 017 056 367 031 283 028 221 392 025 395 150 175 332 377 044 162 427 459 102 371 236 263 363 358 450 042 055 472 128 237 318 171 233 277 006 328 467 165 131 232 355 329 360 176 001 311 380 119 002 161 020 101 005 218 117 126 046 350 279

[n] Cl. perfringens / 1 ml Original RV-Probe - Plattenguss

Clostridum perfringens in Koloniezahl-Agar

250

200

150

100

50

NLGA AS Aurich ZS-RV 2/2002

Labor ID

[n] Cl. Perfringens / 1 ml RV Probe (anaerobe Bebrütung) Abb. 7

Nachweis von Cl. perfringens mCP (membrane-Clostridium perfringens) Agar Bromkresolpurpur (purpur pH 6,8) Cl. perfringens

Saccharose

Säure

gelbe Kolonien

Bromkresolpurpur (gelb pH 5,2) Cl. perfringens-Phosphatase

Phenolphthalein-diphosphat (farblos)

Phenolphthalein Alkalisiserung durch NH3

gelbe Kolonien Hemmung der Begleitflora durch: D-Cycloserin, Polymyxin-B; 44 °C Bebrütungstemperatur

(rot)

rote Kolonien

0

NLGA AS Aurich Z RV 2/ 2002 vor Ammoniumhydroxid-Bedampfung 340 350 389 392 401 438 450 373 380 384 363 344 421 387 419 415 427 377 479 355 439 458 457 395 354 391 412 371 435 467 477 385 472 360 473 367 485 459 420 358

Schleicher & Schüll Cellulose-ME 0,2 µm

178 219 228 244 256 281 297 309 221 318 331 175 232 212 250 279 175 208 237 165 265 329 312 311 200 180 218 305 171 243 176 229 168 198 236 277 293 328 284 331 283 233 206 263

006 025 141 154 016 156 101 004 140 102 128 011 038 042 126 117 017 001 110 005 060 155 058 003 044 014 026 131 119 119 031 036 127 021 150 055 028 162 002 056 161 039 027 046

[n] Cl. perfringens / 100 ml Filtrat

Cl. perfringens auf mCP Agar Fertigplatten (Oxoid) 3 verschiedene Membran-Filtertypen

200

150 PALL-Gelman-Sci Cellulose-ME 0,45 µm Schleicher & Schüll Cellulose-ME 0,45 µm

100

50

Lab.- Id Nr.

nach Ammoniumhydroxid-Bedampfung Abb. 19

Nachweis von Cl. perfringens TSC (Tryptose-Sulfit) Agar

C. perfringens

Sulfit Reduktion

Fe2+ + H2S

H2S

schwarze Kolonien FeS

Hemmung der Begleitflora durch: D-Cycloserin, 44 °C Bebrütungstemperatur Biochemische Differenzierung (n. ISO WD 64616461-2)

C. perfringens zeigt schwarze/graue/gelb-braune Kolonien auf TSC Agar, ist im Nitrat-Beweglichkeitsmedium nicht beweglich, reduziert Nitrat zu Nitrit, bildet im Lactose-Gelatine-Medium Säure aus Laktose und verflüssigt die Gelatine anaerob bei 36 °C innerhalb 44 Stunden.

0 055 141 312 332 389 439 025 421 309 236 305 328 350 244 281 013 311 212 377 318 419 243 219 044 011 243 458 020 371 401 420 415 457 026 036 232 028 014 228 058 155 002 237 283 479 479 256 060 168 180 459 373 360 156 367 003 229 102 233 175 412 247 263 354 031 431 392 340 005 355 004 006 297 265 485 427 467 395 60 391 021 046 198 126 165 358 344 016 384 208 279 150 477 176 038 056 039 117 206 385 218 001 171 221 363 128 017 293 101 277 140 162 127 027 110 119 161 476

[n] KBE / 100 ml Filtrat (entspr. 2 ml Original)

Cl. perfringens auf TSC Fertigplatten (Heipha) Schwärzung durch H2S Bildung

180

160

140

120

100

80

60

40

20

NLGA AS Aurich Z-RV 2/2002

Labor - ID. Nr.

KBE / 100 ml Filtrat - alle Kolonien KBE / 100 ml Filtrat - nur braun-schwarze Kolonien Abb. 10

C. perfringens Isolierungs- und Wiederfindungsraten - Mittelwert

KBE [n] bzw. Wiederfindungsrate [%]

120

größter Mittelwert und höchste Wiederfindungsrate Mittelwert und Wiederfindungsrate

100

80

60

40

20

0 KBE NLGA AS Aurich ZRV 2/2002

TSC SifinHeipha

TSC Sonst.

mCP Sifin-H mCP Sifin-H mCP Sifin-H mCP OXOID mCP OXOID mCP OXOID GN6 SS45 SS20 GN6 SS45 SS20 Methode

n berück. Ergebnisse

Mittelwert

Mittelwert - nach Farbreaktion

Abb. 23

WFR

WFR - nach Farbreaktion

Clostridium perfringens auf mCP-Agar und Membranfiltern div. Chargen mit gleicher Bestellnummer (Wiederfindungsraten) Charge

Haltbarkeit

WFRate mCP/Oxoid

Koloniezahlagar

A A A

08/2004 08/2004 08/2004

123 % 71 % 88 %

100 % 100 % 100 %

03.06.02 11.06.02 27.06.02

B B B

05/2001 05/2001 05/2001

6 4 14

% % %

100 % 100 % 100 %

03.06.02 11.06.02 27.06.02

C C C

12/2001 12/2001 12/2001

2 % 26 % 33 %

100 % 100 % 100 %

03.06.02 11.06.02 27.06.02

D

03/2005

75 %

100 %

27.06.02

Kolonien / 50 ml (Filter)

Legionellen Ring-Vor-Versuch (RV 2-03) 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

GVPC A CellNitr B

GVPC M

GVPC A CME C

GVPC: H A

MWY S

M

C M E der Firma

M

Diese Daten wurden zur Berechnung des Sollbereichs herangezogen !

195 161 161 183 165 183 196 165 195 178 228 178 228 196 197 197 39

X-3S´

Abb. 1 Verteilungsmuster für Legionellen

X-2S´

X (geometr. Mittel)

39

55 172 20 233

X+2S´

1

X+3S´

20 172 233 55 340 340

3

3

192 192 340 340

Legionella / 50ml NLGA RV 2-

Cellulose-Nitrat

Cellulose-Mischester

am Ringversuch sind beteiligt: Dr. Hans-Helmut Geuenich Dr. Katrin Luden Dipl. Ing. Usha Hafermann Grete Höfes Heiko Buß