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EFECTO DE LA ADMINISTRACION DE CORTICOSTERONA EN HIPOCAMPO Y ESTRIADO DORSAL EN CONDICIONAMIENTO DE MIEDO AL CONTEXTO García Lara, L.G.(1); Quirarte, G.L.(2); (1) Facultad de Ciencias Químicas Lic. En Biotecnología Universidad Autónoma de Querétaro (2)
Instituto de Neurobiología
Universidad Nacional Autónoma de México
RESUMEN Se administró corticosterona en dosis de 10 ng / 1µl para los grupos experimentales y vehículo de corticosterona para los grupos control en hipocampo dorsal y estriado dorsal para determinar si tenía efecto facilitador sobre el condicionamiento de miedo al contexto. Se espera que como el hipocampo es esencial en la adquisición y consolidación de la representación contextual tenga dicho efecto facilitador y como la administración de corticosterona en el estriado dorsal en la tarea modificada de evitación inhibitoria no facilitó la memoria en los aspectos contextuales no tenga ningún efecto. INTRODUCCIÓN Las hormonas glucocorticoideas muestran un efecto dosis-dependiente en la consolidación de la memoria en animales y humanos (Roozendaal B., 2000). Los receptores a glucocorticoides (GRs) ubicados en el Estriado, Amígdala Basolateral y Sistema límbico (Hipocampo y Septum) tienen una baja afinidad por corticosterona y son ocupados sólo durante condiciones de estrés (Roozendaal B. y col, 2006). La respuesta de estrés inducida por el aprendizaje de una tarea y la consiguiente liberación de glucocorticoides asociada a la misma, se han implicado en los procesos de consolidación de la memoria, ejercen efectos facilitadores sobre la intensidad con la que se almacena la información recientemente adquirida en una memoria a largo plazo (Sandi C., 2003). La tarea de Condicionamiento de miedo al contexto es un aprendizaje asociativo llamado condicionamiento clásico o también se le puede llamar respondiente o Pavloviano. En donde un estímulo incondicionado (US) produce de manera innata una respuesta incondicionada (UR), luego la asociación o apareamiento de este US con un estímulo neutro, llamado estimulo condicionado (CS) produce la UR. Este apareamiento consecutivo múltiple de los dos estímulos (US + CS) provoca una respuesta condicionada (CR), después el sujeto producirá una CR al ser presentado con un CS, sustituyendo al US. El condicionamiento de miedo al contexto es producto de dos independientes procesos de aprendizaje. Cuando el animal es colocado en un contexto novedoso primeramente realiza la construcción de una representación de las características contextuales que luego la asociará con el evento aversivo generador de miedo. Hay evidencia de que el condicionamiento de miedo al contexto y el condicionamiento de miedo auditivo trabajan de manera independiente. Por ejemplo hay tratamientos que solamente tienen un efecto sobre el condicionamiento de miedo al contexto tales como: la administración crónica de corticosterona lo facilita (Conrad C.D., 2004) al igual que las inyecciones de D-anfetamina en el hipocampo dorsal ya que esta actúa en las neuronas catecolaminérgicas terminales para incrementar la liberación de neurotransmisores cuando la neurona está activa (White y Salinas, 2003). Por otro lado inyecciones sistémicas de antagonistas a glucocorticoides lo disminuye (Pugh C.R. y col, 1997) al igual que las infusiones tanto anterógradas como retrógradas de escopolamina en el hipocampo dorsal ya que induce un bloqueo colinérgico (Wallenstein y Vago, 2001). 1
El hipocampo es esencial en la adquisición y consolidación de la representación contextual. Además una pre-exposición al contexto tiene un efecto facilitador (Barrientos R.M. y col, 2002). Sin embargo la administración de corticosterona en el estriado dorsal (núcleo caudado) en la tarea modificada de evitación inhibitoria no facilitó la memoria en los aspectos contextuales ni emocionales de dicha tarea (Medina A.C. y col, 2007). Entonces los objetivos de este estudio son: determinar si la administración de corticosterona en el hipocampo dorsal facilita la tarea de condicionamiento de miedo al contexto, determinar si la administración de corticosterona en el estriado dorsal tiene algún efecto sobre el condicionamiento de miedo al contexto. METODOLOGÍA Sujetos: Se utilizaron ratas macho de la cepa Wistar con un peso corporal entre 250 - 350 g. Todas las ratas permanecieron en cajas de acrílico individuales, con alimento y agua ad libitum, en el bioterio del laboratorio de Aprendizaje y Memoria del Instituto de Neurobiología, UNAM, con temperatura controlada (22° C) y un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. Cirugía: Se realizó una intervención quirúrgica a las ratas utilizando una dosis de pentobarbital sódico (50 mg/Kg, Sedalphorte) y atropina la misma dosis para todas las ratas (0.4 mg/ml, Atropisa); ambos fármacos fueron administrados intraperitonealmente. Se inyectó por vía subcutánea 1 ml de solución salina isotónica antes de la intervención. Se rasuró la piel del cráneo y se fijó la cabeza en un aparato estereotáxico (Stoelting Co; Illinois). Se incidió la piel a nivel de la línea media en el cráneo en una longitud aproximada de 1.5 cm. y se raspó el tejido perióstico para facilitar la fijación de cánulas al cráneo. Con un taladro para uso fino se hicieron varios orificios pequeños en el hueso del cráneo, cuidando no lesionar la duramadre, a través de los cuales se introdujeron las cánulas guías fabricadas con tubo de aguja hipodérmica de acero inoxidable del número 23. La implantación de las cánulas para el hipocampo dorsal (10 mm) se realizó en las coordenadas: AP, -4.0 mm; ML, ± 2.7 mm, DV, -2.7 mm. La implantación de las cánulas para el estriado dorsal (11 mm) se realizó en las coordenadas: AP, Bregma, ML, ± 3.2 mm, DV, -3.8 mm. La colocación de las cánulas en las estructuras referidas se realizó utilizando el atlas del cerebro de rata de (Paxinos y Watson, 1998). Se colocaron 2 tornillos en el cráneo para un mejor anclaje, y se cubrió la superficie del cráneo con cemento dental además se suturó la piel. A cada cánula se le puso un tapón-estilete de 10 y 11 mm de longitud, dependiendo de la estructura, que se retiró para administrar las drogas. A las ratas se les permitió recuperarse de la intervención quirúrgica durante una semana antes de ser entrenadas. Aparatos: El entrenamiento y la prueba se llevaron a cabo en una cámara de actividad motora, Versamax system, (40.5 cm. de largo, 40.5 cm. de ancho, 26.0 cm. de altura). La actividad animal se mide a través de una red invisible de rayos infrarrojos que se ven interrumpidos cuando el animal es colocado en la caja. La información es recolectada a través de un software fuera del cuarto de experimentación. Una serie de barras igualmente espaciadas (1.17cm.) atraviesan la caja de izquierda a derecha, por las cuales es aplicado el choque. Procedimiento: Para el entrenamiento cada rata es colocada en la cámara de actividad motora donde permanece en exploración por 3 minutos al término de este periodo se le aplica el primer choque con una intensidad de 0.6mA y una duración de 1 segundo. Cada minuto después se le presentará el choque nuevamente hasta terminar el experimento (11 minutos). La rata, a lo largo del experimento, adopta una conducta de disminución de su actividad motora o también llamada freezing, así como otras respuestas conductuales y fisiológicas asociadas al miedo. La prueba se realiza 48 hrs después del entrenamiento, se coloca nuevamente a la rata en la cámara de actividad motora donde permanece 11 minutos pero esta vez no se le aplica ningún choque. 2
Preparación de fármacos y Microinyecciones: El stock de corticosterona se preparó con 5mg de corticosterona disuelta en 3.33 ml de etanol, de ahí se preparó la dosis de 30 ng (200 µl del stock + 9,800 µl de solución salina isotónica) y de 10 ng (2,000 µl de dosis de 30 ng + 4,000 µl de solución salina isotónica) y el vehículo se preparó con 19,600 µl de solución salina isotónica + 400 µl de etanol. La dosis de 10 ng para el grupo experimental y el vehículo para el grupo control, fue lo que se administró inmediatamente después del entrenamiento con una bomba de infusión lenta (WPI modelo sp200i), en la que se colocó una jeringa Hamilton de 10 µl, conectada a través de un tubo de polietileno calibre PE-20 a un inyector de 11 mm de longitud para hipocampo dorsal o de 12 mm para estriado dorsal, fabricada con tubo de aguja hipodérmica de acero inoxidable del número 30. La administración de los fármacos tanto para el hipocampo dorsal como para el estriado dorsal se llevó a cabo en un volumen de 1µl durante 1 min. RESULTADOS
Figura 1. Se muestra el promedio y error estándar de la actividad motora en los entrenamientos y las pruebas para hipocampo y estriado dorsal en el grupo control y en el experimental. Estriado dorsal. En el grupo vehículo según la prueba estadística de anova de medidas repetidas se obtuvo f 10, 10 = 11.218 P < 0.0001, lo que significa que este grupo si aprendió la tarea. En el grupo experimental, corticosterona 10 ng / 1 µl, se obtuvo f 9, 10 = 14.105 P < 0.0001, lo que significa que este grupo también aprendió. En la adquisición de un cambio en la conducta a través 3
del tiempo, producto de la experiencia, (aprendizaje) en el día del entrenamiento no hubo diferencias significativas entre los grupos vehículo y experimental en ninguno de los minutos a partir de que se recibe el primer choque según la prueba estadística de t- de student. P > 0.05. Hipocampo dorsal. En el grupo vehículo según la prueba estadística de anova de medidas repetidas se obtuvo f 4, 10 = 3.310 P < 0.0031, lo que significa que este grupo si aprendió la tarea. En el grupo experimental, corticosterona 10 ng / 1 µl, según la prueba estadística de anova de medidas repetidas se obtuvo f 3, 10 = 3.030 P < 0.0091, lo que significa que este grupo también aprendió. En la adquisición de un cambio en la conducta a través del tiempo, producto de la experiencia, (aprendizaje) en el día del entrenamiento no hubo diferencias significativas entre los grupos vehículo y experimental en ninguno de los minutos a partir de que se recibe el primer choque según la prueba estadística de t- de student. P > 0.05. En la prueba de retención, a las 48 hrs, de estriado dorsal e hipocampo dorsal no hay diferencias significativas entre los grupos en ninguno de los puntos según la prueba estadística de t- de student P > 0.05. CONCLUSIONES Las memorias involucradas en esta tarea son: la memoria emocional, ya que es un condicionamiento aversivo; la memoria espacial, ya que la rata adquiere y retiene asociaciones de las características contextuales y la memoria declarativa episódica. La administración de corticosterona en ratas de 250-350 gr en dosis de 10 ng / 1 µl en el estriado dorsal e hipocampo dorsal inmediatamente después del entrenamiento de una tarea de condicionamiento de miedo al contexto no produce facilitación de la memoria. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Barrientos R.M., O’Reilly R.C., Rudy J.W., “Memory for context is impaired by injecting anisomycin into dorsal hippocampus following context exploration”, Behavioural Brain Research, 134, 299-306, 2002 Conrad C.D., “Influence of chronic corticosterone and glucocorticoid receptor antagonism in the amygdala on fear conditioning”, Neurobiology of learning and memory, 81, 185-199, 2004 Medina A.C, Charles J.R., Espinoza-González V., Sánchez-Resendis O, Prado-Alcalá R.A., Roozendaal B., Quirarte G.L., “Glucocorticoid administration into dorsal striatum facilitates memory consolidation of inhibitory avoidance training but not of the context or footshock components”, Learning and memory, 14, 673-677, 2007 Pugh C.R., Fleshner M., Rudy J.W., “Type II Glucocorticoid receptor antagonists impair contextual but not auditory-cue fear conditioning in juvenile rats” , Neurobiology of learning and memory, 67, 75-79, 1997 Roozendaal B., “Glucocorticoids and the regulation of memory consolidation”, Psychoneuroendocrinology 25:213- 238, 2000 Roozendaal B, Okuda S, Quervain D. J.-F y McGaugh J.L., “Glucocorticoids interact with emotion-induced noradrenergic activation in influencing different memory functions”, Neuroscience ,138:901-910, 2006 Sandi C., “Implicación de los glucocorticoides en la consolidación de la memoria”, Rev. Neurol., 37, 843-848, 2003 Wallenstein G.V., Vago D.R., “Intrahippocampal scopolamine impairs both acquisition and consolidation of contextual fear conditioning”, Neurobiology of learning and memory, 75, 245252, 2001 White N. M., Salinas J. A., “Mnemonic functions of dorsal striatum and hippocampus in aversive condiotioning”, Behavioural Brain Research, 142, 99-107, 2003 4
