el uso de los rapos como marcadores moleculares en

Boletín de la Sociedad Botánica de México 60: 85-117, 1997 DOI: 10.17129/botsci.1523 Bol. Soc. Bot. México 60: 85-117 (1997)

EL USO DE LOS RAPOS COMO MARCADORES MOLECULARES EN PLANTAS

ADRIANA ÜTERO ARNAIZ, MARLENE .DE LA CRUZ y KEN ÜYAMA Instituto de Ecología, Universidad Nacional Autónoma de México, Apartado Postal 70-275, Ciudad Universitaria, 04510 México D.F., México.

Resumen. Se presenta una revisión de los marcadores moleculares denominados RAPDs (pronunciado "rapids"; de su nombre en inglés: Random Amplified Polymorphic DNA; su traducción al español: Polimorfismos de ADN Amplificados a l Azar). Se presentan sus principales aplicaciones en estudios de mapeo genético, identificación de características de interés, genética de poblaciones, identificación, variación genética intrae in ter-específica, filogeni as y biología de la conservación. Se ha demostrado, en general, que los RAPDs como marcadores moleculares son útiles en problemas de estimación de la diversidad genética, identificación de taxa, clones, variedades e híbridos. Sin embargo, se ha cuestionado su uso en sistemática en la resolución de relaciones filogenéticas principalmente por las dificultades en las determinaciones de la identidad, homología e independencia de los caracteres de interés. Se describen brevemente los métodos de análisis que se han empleado para estudios de variación genética. Al final se presentan algunos de los desarrollos recientes tanto en técnicas como métodos de a nálisis de marcadores basados en PCR. Palabras clave: estructura genética, filogenias, marcadores moleculares, PCR, RAPDs. Abstract. In this paper a review of RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA) as molecular markers is presented. This molecular marker has been used to genetic mapping, population gertetic structure, genetic identification, intra and interspecific variation, reconstructing phylogenies and conservation biology. In general, RAPDs have been useful to estimate genetic diversity, genetic identification of taxa, clones, varieties and hybrids. However, their use in Systematic has been questioned due to the difficulties in the determination of identity, homologies and independence of characters. Methods of a nalyses used to estímate genetic diversity a re briefly described. Finally, sorne recent advances and new technics based on PCR are presented. Key words: molecular markers, PCR, phylogenies, population genetic structure, RAPDs .

L

as estrategias clásicas para la detección de variación (anatomía, morfología, embriología y fisiología comparadas) han sido completadas con técnicas moleculares. Estas técnicas incluyen el análisis de los constituyentes químicos y la caracterización de macromoléculas. Los marcadores moleculares son una serie de métodos de análisis genético-moleculares que se basan en la detección de polimorfismos en proteínas y ADN, cuyos principios y técnicas se han utilizado para resolver problemas específicos en genética y ecología de poblaciones, evolución de sistemas reproductivos, mapeo genético de caracteres de interés agronómico, procesos de hibridización e introgresión, determinación de patrones biogeográficos, resolución e identificación de relaciones taxonómicas, reconstrucción de filogenias y biología de la conservación.

En los últimos años se han desarrollado las estrategias generales para la detección de polimorfismos moleculares como hibridización molecular, amplificación enzimática y secuenciación de ADN. Un ejemplo de esto es la introducción de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Polymerase Chain Reaction) (Saiki et al., 1988; Erlich y Arnheim, 1992) , un método in vitro de amplificación enzimática de segmentos específicos de ADN que ha simplificado el estudio de la variación genética y ha transformado la manera en que se llevan a cabo los análisis genéticos. A principios de esta década, dos grupos de investigación independientes describieron simultáneamente una técnica para detectar niveles de polimorfismo. Por un lado, Williams et al. (1990) describieron aplicaciones de mapeo genético y denominaron al nuevo 85

____________ Otero-Arnaiz A, de la Cruz M, Oyama K. 1997. El uso de los RAPDs como marcadores moleculares en plantas. Boletín de la Sociedad Botánica de México 60: 85-117.

ADRIANA ÜTERO ARNAIZ, MARLENE DE LA CRUZ Y KEN ÜYAMA

método como RAPDs (de sus siglas en inglés Random Amplified Polymorphic DNA). Por otra parte, Welsh y McClelland (1990) se avocaron a realizar estudios de identificación ("fingerprinting") del genoma y denominaron a su ensayo AP-PCR (de sus siglas en inglés: Arbitrarly Polymorphisms-Polymerase Chain Reaction; su traducción al español: polimorfismos arbitrarios-PCR). Los RAPDs son marcadores moleculares generados por la amplificación de segmentos aleatorios de ADN. La técnica es una variación de la reacción en cadena de la polimerasa. En esta reacción se amplifican segmentos de ADN. Para que se lleve a cabo la reacción se requiere del ADN que se desea amplificar, una enzima termoestable conocida como Taq (aislada de la bacteria Thermus aquaticus); magnesio como cofactor de la enzima; secuencias cortas de oligonucleótidos (e.g., 10 pares de bases) conocidas como "primers" y nucleótidos libres. La reacción de amplificación se lleva a cabo mediante cambios de temperatura. El ADN se desnaturaliza por calor a 94º c y al disminuir la temperatura (aproximadamente 37º C) el oligonucleótido se alinea a uno o varios sitios homólogos en la cadena de ADN desnaturalizada. Para evitar las alineaciones que no son completamente homólogas se eleva nuevamente la temperatura a 54° C y finalmente se mantiene la temperatura óptima para la enzima (72° C) y de esta forma comenzar la fase de replicación. Los segmentos de ADN amplificados con esta técnica son separados por medio de electroforesis en geles de agarosa, teñidos con bromuro de etidio y visualizados con luz ultravioleta (Welsh y McClelland, 1990; Williams et al., 1990; Rafalski et al., 1991; Whitkus et al., 1994). Esta técnica se basa en la probabilidad estadística de que se presenten sitios complementarios al oligonucleótido a lo largo del genoma. Las bandas son generadas por la existencia de varios sitios de acoplamiento para un oligonucleótido particular. Los polimorfismos (e.g., las diferencias en el número de bandas) entre los individuos generados por los RAPDs se deben a cambios en la secuencia de los nucleótidos en los sitios de acoplamiento y por inserción o deleción de los fragmentos en estos sitios (Williams et al., 1990) . Como una regla, los productos de amplificación individuales representan un alelo por locus (Waugh y Powell, 1992). Las mutaciones que inhiben el alineamiento del oligonucleótido o que de alguna forma previenen la amplificación son detectadas por la ausencia (e.g., pérdida de bandas) de fragmentos amplificables de ADN. Con esta técnica no es posible distinguir homócigos dominantes de h e terócigos para un fragmento particular (Whitkus et al., 1994; Backeljau et al., 1995) .

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Los RAPDs se conocen como marcadores dominantes/ recesivos ya que el carácter que se obtiene es la presencia/ausencia de una secuencia amplificable de ADN. Por lo tanto, los términos dominante y recesivo aplicados a los datos de RAPDs sólo se refieren a la amplificación o no durante la reacción en cadena de la polimerasa. Desde la proposición de los RAPDs como marcadores moleculares se han desarrollado diversas modificaciones; además del ya mencionado AP-PCR, existe la propuesta del llamado DAF (DNA Amplification Fingerprinting) (Caetano-Anollés et al., 1991). Las ventajas de los RAPDs en términos de costo y tiempo, han hecho de este marcador molecular uno de los más utilizados en diversos campos de la biología. El objetivo de este artículo es presentar una revisión del uso de los RAPDs como marcadores moleculares tanto de su marco teórico y sus métodos de análisis, como su aplicación a distintos problemas de las ciencias vegetales. Se discuten las ventajas y desventajas de estos marcadores comparándolos con otros reportados en la literatura. Esta revisión consistió en una búsqueda exhaustiva de la bibliografía disponible sobre el tema. Se revisaron un total de 389 de 459 artículos publicados. Se decriben algunos ejemplos representativos de la literatura y el resto se presentan en diferentes cuadros de acuerdo con su temática. Los RAPDs como marcadores moleculares

En esta sección se presentan las principales aplicaciones de los RAPDs como marcadores moleculares en diversos problemas de genética, ecología y evolución de las plantas. Estudios de mapeo genético e identificación de caracteres de interés. La elaboración de mapas genéticos es una he-

rramienta importante para diseñar estrategias dentro de los programas de producción, ya que permite manipuiar características de interés agrícola con cierto grado de confiabilidad. Utilizando tanto líneas isogénicas como diferentes generaciones (F 1, F 2 ) de plantas cultivadas, se ha logrado identificar rápidamente marcadores ligados a genes de resistencia a diferentes enfermedades causados por virus, bacterias, hongos, insectos y nemátodos (cuadros 1, 2 y 3). U na de las especies más estudiadas es el tomate en donde en pocos años se han detectado genes de resistencia a hongos, nemátodos y algunos virus (Bai et al., 1995; Klein-Lankhorst et al., 1991; Kawchk et al., 1994; Ohmori et al., 1995, 1996). Dweikat et al. (1994, 1997) identificó marcadores RAPDs asociados a dos o más genes que confieren resiste ncia contra el insec to Mayetiola destructor, una de las principales plagas de

LOS RAPDS COMO MARCADORES MOLECULARES

Cuadro 1. Estudios sobre identificación de características de interés utiliz ando RAPDs como marcadores moleculares. Familia

Especies

Anacardi aceae Asteraceae Cariophy l 1aceae Chenopodiaceae

Pistacia vera Helianthus annuus Si/ene latifolia Beta vu lgaris

Cruciferae

Brassica napus B. napus y B. rapa

Eu phorbiaceae Gramineae

Manihot escu lenta Avena spp. Digitalis obscura Hordum sp. Hordeum vulgare H. vu lgare

Leguminosae

H. vulgare Oryza sativa O. sativa Pennisetum ciliare Pennisetum spp. Triticum aestivum Triticum spp. Zea mays Medicago sativa M. sativa

Phaseolus vu lgaris P. vulgaris P. vu lgaris P. vu lgaris P. vulgaris

Onagraceae Pinaceae

Rosaceae

P. vulgaris Oenothera villaricae y O. picensis Picea abies Pinus pinaster Ma lus floribunda Prunus persica

~

Determ in ación del sexo Resistencia a hongos D eterminación de l sexo Esteril idad o fertilidad masculina Esterilidad masculina Concentración de ácido · palmítico y linoleico Apomixis Genes de asimi lación de cadmio Síntesis de cardenoloides Resistencia a hongos Resistencia a virus Requerimiento de energía Resistencia a hongos Resistencia a insectos Esterilidad masculina Apomixis Apomixis Resistencia a hongos Resistencia a insectos Varias característ icas Embriogénesis somática Identificación de progenies de autofecundación y de fecundación cruzada Resistencia a hongos Res istencia a hongos Resistencia a plagas Resistencia a hongos Resistencia a enfermedades Res istenc ia a virus Morfología de polen Dominancia apica l Genes ligados a crecim iento Resistencia a hongos

Capsicum spp.

Genes de interés económico Crecimiento anormal

Lycopersicon escu lentum L. esculentum L. escu lentum

Resistencia a nemátodos Resistencia a hongos Resistencia a virus

Nicotiana debneyi

Resistencia a hongos

y P. dulcis Solanaceae

Objetivo

Nivel de estudio

Referencia

Híbridos Progenie F2 In dividuos Líneas isogénicas

Hormaza et al. (1994b) Lawson et al. (1996) Mu lcahy et al. (1992) Lorenz et al. (1997)

Cu lti vares Progenie F2

Delourme et al. (1994) Tanhuanpaa et al. (1995 a b) Grattapaglia et al. 996 b) Penner et al. (1995)

Híbridos Líneas isogénicas Poblaciones (cultivo de tejidos) Progenie F2 Cultivares Población doble haploide Progenie Fl Progenie Fl Cultivares Cu lti vares Especies y variedades Líneas isogénicas Líneas isogénicas Individuos Progenie Fl Población

n

Gav idia et al. (1996) Barua et al. (1993) Ordon et al. (1997) Chalmers et al. (1993) Kutcher et al. (1996) Nair et al. (1995) Zhang et al. (1997) Gusti ne et al. (1996) Lubbers et al. (1994) Procun ier et al. (1995) Dweikat et al. (1994, 1997) Gourmet & Rayburn (1996) Yu y Pau ls (1993) Gjuric y Smith (1996)

Progenie F2 Líneas isogénicas Progenie F2

Young y Kelly (1996) Haley et al. (1993) y Johnson et al. (1995) Haley et al. (1994 a) Mahé et al. (1995) Miklas et al. (1996)

Progenie F2 Especies

Urrea et al. (1996) Gambier y Mulcahy (1996)

Progenie F2 Progenie F2

Lehner et al. (1995) Plomion et al. (1996 a)

Cultivares

Yang y Krueger (1994) y Yang et al. (1997) Warburton et al. (1996)

Líneas isogén icas Cultiva res

Híbridos i nterespecíficos Híbridos i nterespecíficos Líneas isogénicas Líneas isogénicas Líneas isogénicas Líneas isogénicas

lnai et al. (1993) Klein -Lankhorst et al. (1991) Kawchuk et al. (1994) Ohmori et al. (1995 , 1996) Bai et al. (1995)

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ADR!ANA ÜTERO ARNAIZ, MARLENE DE LA CRUZ y KEN ÜYAMA

Cuadro 2. Lista de estudios de mapeo de cromosomas utilizando RAPDs como marcadores moleculares.

Familia

Especie

Nivel de estudio

Referencia

Asteraceae Caricaceae Convolvulaceae Cruciferae

Helianthus anomalus

Híbrido Progenie F2 Progenie Fl Progenie doble-haploide Progenie F2 Híbridos Progenies F2 y F3 Híbridos interespecíficos

Rieseberg et al. (1993) Sondur et al. (1996) Thompson et al. (1997) Foisset et al. (1996) Truco y Quiros (1994) Hashizume et al. (1996) Kennard et al. (1994) Qu y Hancock (1997)

Híbridos interespecíficos Progenie F2 Progenie doble-haploide Progenie Fl Híbridos interespecíficos Progenies Fl, F2 y F3 Progenie F2 Progenie F2 Cultivares Híbridos interespecíficos

Rowland y Levi (1 994) Schulz et al. (1994) Giese et al. (1994) Mudge et al. (1996) Al-Janabi et al. (1 994) Pammi et al. (1994) Chittenden et al. (1994) Beaumont et al. (1996) Lin y Chou (1997) Lin y Ritland (1996)

Progenie F2 Progenie F2

Satovic et al. (1996) Kaga et al. (1996 a)

Cultivares Progenie F2 Segregación en tres generaciones Híbridos interespecíficos Progenie F1 Progenie F1 (tejido haploide) Progenie Fl Híbridos interespecíficos Progenie F2 Población (segregación en tres generaciones) Población Progenie F2

Jiang et al. (1997) Fauré et al. (1993) Byrne et al. (1995)

Cucurbitaceae Ericaceae

Graminae

Leguminosae

Liliaceae Musaceae Myrtaceae

Pinaceae

Rosaceae

Carica papaya lpomea batatas Brassica napus B. nigra Citrullus lanatus Cucumis sativus var. sativus Vaccinium darrow y V. corymbosum V. darrowi y V. el/iottii Daucus carota ssp. sativus Hordeum vulgare Saccharum officinarum S. officinarum y S. robustum Sorghum bicolor ssp. bicolor S. bicolor x S. robustum Zea mays Z. mays Mimulus platycalyx y M. guttatus Vicia faba Vigna angularis y V. nakashimae Asparagus officinalis Musa acuminata Eucalyptus nitens E. urophylla y E. grandis Picea abies Pinus brutia P. elliottii var. elliottii P. palustris y P. elliottii P. pinaster P. radiata Prunus avium P. persica

Rutaceae Sillicaceae Solanaceae

Solanaceae Stercul iaceae Ta xod iaceae Umbelacaceae

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Citrus grandis y Poncirus trifoliata Populus trichocarpa y P. deltoides Lycopersicon esculentum y L. pimpinellifolium L. esculentum y L. plennenllii Lycopersicon spp. Lycopersicon spp. Petunia spp. Theobroma cacao Cryptomeria japonica Apium graveolens var. rapaceum y var. secalinum

Verhaegen y Plomion (1996) Binelli y Bucci (1994) Kaya y Neale (1995) Nelson et al. (1993) Kubisiak et al. (1995) Plomion et al. (1995 a,b) Devey et al. (1996)

Híbridos intergenéricos

Stockinger et al. (1996) Rajapakse et al. (1995) y Chaparro et al. (1994) Caí et al. (1 994)

Híbridos interespecíficos

Bradshaw et al. (1994)

Progenie F2

Grandillo y Tanksley (1996)

Progenie F1 Progenie F2 e híbridos i nterespecíficos Híbridos interespecíficos Cultivares Progenie F2 Segregación en tres generaciones Progenie F2

Fooland et al. (1993) Chunwongse et al. (1994) Klein-Lankhorst et al. (1991) Peltier et al. (1 994) Lanaud et al. (1995) Mukai et al. (1995) Yang y Quiros (1995)

LOS RAPOS COMO MARCADORES MOLECULARES

este cultivo ( Triticum aestivum). Con 18 oligonucleótidos identificaron marcadores asociados a once diferentes loci de resistencia logrando distinguir entre líneas con o sin resistencia. Michelmore et al. ( 1991) desarrollaron el método de análisis de segregación en conjunto para identificar marcadores en regiones específicas del genoma. Dentro de cada conjunto los individuos son idénticos para la característica o gen de interés. Dos conjuntos contrastantes para la característica de interés pueden ser polimórficos o monomórficos para el resto de las regiones. Al analizar ambos conjuntos se identifican a los marcadores que los distinguen. Ellos identificaron eficientemen te marcadores RAPDs ligados a un gen de resistencia a patógenos para el cual no existían líneas isogénicas cercanas. Algunos mapas se han elaborado con poblaciones doble-haploide, lo cual es más recomendable si se utilizan RAPDs como marcadores ya que con estas poblaciones hay una mejor estimación de la frecuencia de recombinación obtenida para marcadores dominantes (Foisset et al., 1996). En plantas, uno de los problemas más intrigantes ha sido la determinación del sexo. El dioicismo por ejemplo, ha evolucionado independientemente en diferentes familias y géneros y existen diferentes mecanismos de regulación genética. Un análisis de segregación utilizando RAPDs permite identificar marcadores asociados al sexo. El reconocimiento del sexo fuera de su fase reproductiva tiene implicaciones muy relevantes en las investigaciones tanto de plantas cultivadas como silvestres. Para mencionar un caso, el estudio de la selección sexual en las plantas perennes podría tener un salto cualitativo si se pudieran sexar las plántulas y juveniles de las poblaciones naturales. El heteromorfismo cromosómico entre sexos es poco común en plantas; uno de los pocos géneros con esta diferenciación es Silene que presenta cromosomas femeninos y masculinos. Mulcahy et al. (1992) encontró marcadores producidos por RAPDs asociados al sexo en Silene latifolia. Por su parte, Hormaza et al. (1994 b) encontró oJigonucleótidos específicos asociados al sexo de Pistacia vera. La expresión del sexo en Asparagus officinalis es controlado por el gen M Qiang et al., 1997), siendo los machos heterócigos y las hembras .homócigas. Estos autores encontraron dos fragmentos generados por el mismo oligonucleótido para diferenciar machos y hembras. El análisis de segregación en cruzas entre genotipos cercanos ha revelado algunos genes responsables de características de los sistemas de apareamiento en plantas (Hormaza et al., 1994 b; Lubbers et al., 1994; Gambier y Mulcahy, 1996). El mapeo de caracteres

cuantitativos permite entender de forma más precisa los sistemas de apareamiento. La técnica de RAPDs es una de las más sencillas y accesibles para mapeo genético de especies silvestres. Existen varios mapas generados en plantas cultivadas pero éstos no explican los cambios evolutivos que ocurren en la naturaleza . Por esto, es necesario hacer estudios detallados en poblaciones silvestres. Hasta el momento, se han hecho mapas genéticos con RAPDs para tres géneros silve~tres: Microseris (van Houten et al., 1994; Hombergen y Bachman, 1995), Helianthus (Rieseberg et al., 1993) y Mimulus (Lin y Ritland, 1996) . Estos mapas han permitido examinar las bases genéticas de caracteres morfológicos en Microseris, analizar los grupos de genes ligados para estudios de introgresión e hibridización entre especies de Helianthus y estimar la aditividad, dominancia y efectos epistáticos de las características cuantitativas en la evolución del apareamiento de Mimulus (Lin y Ritland, 1996). Identificación genética

El análisis de ADN amplificado usando la técnica de ha permitido generar información sobre la identificación molecular de individuos, la estructura de apareamiento local y las relaciones de parentesco (paternidad) (cuadro 4). Una de las mejores aplicaciones de de los RAPDs como marcadores es la identificación genética de individuos dado el gran polimorfismo que detectan. Esta identificación incluye casos de clones, híbridos somáticos, mutantes, etc. Otra aplicación paralela es la detección de uniformidad genética con un marcador eficiente y rápido, lo cual puede ser útil en la determinación de estabilidad genética en programas de reforestación. La teoría clásica de regulación poblacional se basa en un concepto de individuo bien delimitado (Antonovics y Levin, 1980). Sin embargo, en plantas clonales la organización jerárquica no permite la delimitación del individuo o "genet" . Un "genet" comprende unidades funcionales conocidas como "ramets" los cuales son potencialmente independientes fisiológicamente. La mayor parte de los estudios de dinámica y regulación de poblaciones de plantas clonales se han enfocado al nivel de "ramets" ya que es muy difícil identificar en el campo a los "genets". Sin embargo, el probar hipótesis sobre la estructura de las poblaciones de especies clonales requiere de la identificación inequívoca de los "genets". El análisis con RAPDs es un método robusto para probar hipótesis de estructura poblacional clonal, ya que permite la identificación genética de los individuos producidos tanto por vías asexuales como sexuaRAPDs

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ADRIANA ÜTERO ARNA IZ, MARLENE DE LA CRUZ Y KEN ÜYAMA

Cuadro 3. Estudios sobre mapeo gen ético de gen.es o loc i específi cos utilizando RAPDs como marcado res mo lec ul ares. Fam il ia

Especie

O bjetivo

Nivel tax onomico

Referenci a

Asteraceae

Helianthus annus

Gen PI 1, resistencia a

Proge ni e F2

Mouzeya r et al. (19 95)

Plasmopara halstedii Lactuca sativa L. serriola

Gen Tu , resistenc ia al vi ru s del mosa ico Genes Rl 7 y Rl 8, resistenc ia a Bremia

Variedades (progenie F3) Robbins et al. (1994) Proge ni es F2 y F3

Mai sonn euve et al. (1 99 4)

Proge ni e F2

Hombergen y Bachmann (1995) Sc ho lten et al. (1 997)

lactucae Chenopod iaceae

Microseris douglasii y M. bigelovii Beta vulga ris

Gen qu e regul a la fo rmació n de tri comas Resistencia a

8. vu lgaris

Heterodera schachtii Resistencia a H. schachtii y co lor del

Subes pec ies, proge nie F2 Culti vares (progenie F2)

U phoff y Wricke (199 2)

Cul tiva res

Sa lent ijn et al. (1995)

Culti vares (progeni e F2 y dob le hap loide)

Delourme et al. (1994)

Líneas isogéni cas ce rcanas y progen ie dob le-hap loide Progen ie doble haploide Proge ni e F2

Fo isset et al. (1995)

hi pocótil o

8. vulgaris y 8. patellaris Loc us Hsl pa1- 1, Cruciferae

B. napus

resistencia a a Heterodera schachtii Gen Pgi-2-Rfo restaurador de la fert ili dad mascu lina Ge n Bz h

8. napus

Va ri as caracte rísticas

8. napus

Genes respo nsables de la co ncentrac ión de ác ido lino leico Gen SI de auto incompat ibili dad Loc us que afecta la conce ntrac ión de ác ido oléico Genes de res istenc ia y marcadores morfo lóg icos

Brassica napus

8. o/eraceae 8. rapa ssp. oleifera Cucurb itaceae

Gramineae

Cucumis sativus var. sativus y C. s. var. hardwickii Oryza sativa

Fo isset et al. (1996) H u et al. (1995)

(am argo et al. (1 997)

Híbr idos interespecíficos Cul tiva res (proge ni e F2)

Tanh ua npaa et al. (1996)

Proge ni e F2

Ken nard et al. (1 994)

Ge n Gm2, y Gm 4t re- Lineas isogenicas, sistenc ia a Orseolia · proge nies F5, F6 y F3

Mohan et al. (1994) Nair et al. (1995, 1996)

osyzae O. sativa

Oryza sp . Triticum aestivum T. spelta

Gen de esteril idad mascu lina Gen xa-13, res istencia a Xanthosomonas oryza Loci 1RS de Seca/e cera/e Gen Lr9 y Gen Lr24 res istencia a Agropyron

Cultivares (progenies F2) Líneas isogénicas y progenie F2 Líneas isogénicas Líneas isogénicas (progenies F2 y F3)

Wa ng et al. (1995) Z hang et al. (1 996) lqba l y Rayburn (1995) Schac herm ayr et al. (1994 y 1 995)

elongatum T. turgidum var durum T. aestivum

90

Genes OPC-20 y UBC180, Toma de cadmio Genes de resistencia Lr29 y Lr25

Progen ie Fl

Pen ner et al. (1995)

Líneas isogénicas

Proc un ier et al. (1995)


Familia

Especie

Objetivo

Nivel taxonomico

Leguminosae

Glycine max y C. soya Phaseolus vulgaris

Loci que controla el peso de la semil la Gen Are, resistencia a

Híbridos interespecíficos Maughan et al. (1996) Lín eas isogénicas

Adam-Blondon et al. (1994)

Líneas isogénicas

H aley et al. (1994b)

Cultivares

Young y Kelly (1996)

Cultivares (progenie F3) Líneas isogenicas, F3 y F4

Timm erman-Vaughan et al. (1996) Timmerman et al. (1994)

Col/ectotrichum lindemuthianum

P. vulgaris

Locus Ur-3, resistencia a Uromyces

P. vulgaris

Gen Are, resistencia a

Referencia

appendicu /antus Colletotrichum lindemuthianum Pisum sativum

Myrtaceae Pinaceae

P. sativum ssp. humile y P. sativum ssp.

Loc i que afecta el peso de la sem illa Gen er-1, re sistencia a Erysiphe pisi D.C.,

satiivum Eucalyptus grandis y E. urophyl/a Pinus el/iottii var. elliottii

Loci que co ntro la la Progenie F1 propagación vegetativa Resistencia a Cronartium Población (c lones y quercuum f. sp. su progenie)

P. p inaster P. pinaster Ma lus floribunda

Altura de plántulas Careno 8-3 Gen Vf, resistencia a

Ma/us sp.

Gen Sd-1, resistencia a Dysaphis devecta Gen Vf, resistencia a

Grattapagl ia et al. (1995 y 1996 a) Nelson et al. (1993)

fusiforme

Rosaceae

Progenie F2 Progenie F2 Progenie F1

Plomion et al. (1996a) Plomion et al. (1996) Tartarini (1996)

Cultivares

Roche et al. (1997)

Cultivares

Yang y Korban (1996) y Yang et al. (1 997)

Venturia inaequalis

Malus sp.

Venturia inaequalis Prunus persica y P. davidiana

Resistencia a

Sphaerotheca pannosa

So lanaceae

P. persica y P. du lcis

Varias características

Lycopersicon escu lentum L. esculentum

Gen Sw-5, resiste ncia al virus TSWV Gen Mi, resistencia a nematodos Gen 0 1-1 , resistencia

L. esculentum y L. hirsitum L. escu/entum y L. peruvianum L. esculetum

Lycopersicon spp.

a Oidium lycopersicum Gen Tm-2 , resistencia al v iru s del mosaico Resistencia al virus TSWV Gn Lv, resistencia a

Leveil/ula taurica So /anum spp. Ulm aceae

U/mu s spp .

Loci que contro la la latencia del tubérculo Gen Bis, resistencia a

Dirlewanger et al. (1996) Híbridos interespecíficos Warburton et al. (1996) .(p rogenies F2 y F3) Va ri edades Chagué et al. (1996) (progenie F2) • Líneas isogénic as y Wil liamson et al. (1994) progenie F2 Híbridos van der Beek et al. (1994) i nterespecíficos (progen ies F2 y F3) Híbridos interespecíficos Dax et al. (1993) (Progen ie F2) Líneas isogénicas Steve ns et al. (1995) Híbridos interespecíficos

Progenie F2 e híbridos Chunwongse et al. (1994) i nterespecíficos Híbridos interespecíficos Freyre et al. (1994) Hibridos interespecíficos Benet et al. (1 995)

Stegophora u/mea

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ADRIANA ÜTERO ARNAIZ, MARLENE DE LA CRUZ y KEN ÜYAMA

les (Castiglione et al., 1993; Eriksson y Bremer, 1993; Trame et al., 1995; Miller et al., 1996; Scheepers et al., 1997). Eriksson y Bremer ( 1993) en un estudio de regulación poblacional de Rubus saxatilis identificaron genéticamente a los "genets" y sus resultados fueron contrastantes a los encontrados utilizando "ramets" (Hutchings, 1979). En este tipo de estudios los RAPDs son preferibles a las enzimas o a otros marcadores moleculares ya que la dominancia no impide la identificación, la cual se ve más bien afectada por los niveles de polimorfismo dentro de la especie. Por ejemplo, Rosetto et al. (1995) obtuvieron una probabilidad de 4.3 x 10- 10 de encontrar dos individuos con el mismo patrón de bandeo para once oligonucleótidos en poblaciones de Grevillea scapigera. Esto nos da una idea de la capacidad de identificación individual de este marcador. Un factor importante en los programas de aprovechamiento de especies cultivadas es el incremento de la capacidad genética de las especies. Las especies silvestres emparentadas con las cultivadas son cruzadas para introducir genes específicos dentro de las cultivadas. Cuando la incompatibilidad sexual o las distancias genéticas impiden la introducción sexual de recursos genéticos, la hibridización somática puede usarse para combinar genomas completos o parciales. Esta técnica comprende el aislamiento y fusión del protoplasma y la regeneración de plantas maduras a partir de las células fusionadas. Una selección in vitro de los posibles híbridos somáticos se lleva a cabo para escoger a los genotipos que tienen las características seleccionadas (Kaendler et al., 1996). Baird et al., (1992) describe un método basado en el uso de los RAPDs para identificar inequívocamente h íbridos somáticos intra e inter-específicos en los primeros estadios de regeneración utilizando uno y dos oligonucleótidos. El uso de un sólo oligonucleótido genera una amplificación típica para cada genotipo de los donadores y confirma la presencia de estos genotipos en los híbridos. El uso de dos oligonucleótidos, en donde cada uno de éstos ha amplificado fragmentos específicos para cada donador, da información adicional para identificar la hibridización somática. Por otra parte, existen mutaciones somáticas que afectan la estructura y productividad vegetal. Las plantas con estas mutaciones pueden diferir del resto de los individuos de la especie en algunas características morfológicas aunque es muy difícil distinguirlas genéticamente. El uso de RAPDs ha sido exitoso para distinguir mutantes generados con rayos X del híbrido entre Prunus cerasus x P. canenscens con 60 oligonucleótidos (Yang y Schmidt, 1994) y mutantes del limón ( Citrus liman) con 22 oligonucleótidos (Deng et al., 1995). Sin embargo, Wolf y Peters-van Rijn (1993)

92

no pudieron distinguir treinta mutantes del crisantemo (Dendranthema grandiflora) que diferían en el color de las flores. Otra aplicación interesante es la detección de estabilidad genética en especies de plantas propagadas por cultivo de tejidos. Por ejemplo, utilizando RAPDs como marcadores, Isabel et al. (1993) en Picea mariana y Heinze y Schmidt ( 1995) en P. abies no detectaron variación en plantas propagadas para programas de reforestación. Por su parte, Martín y Pérez (1994) encontraron el uso de los RAPDs como un marcador útil para detectar tanto diversidad como estabilidad genética para propagar plantas en peligro de extinción. Genética de poblaciones

La extensión y distribución de la diversidad genética de las poblaciones es el resultado de la interacción entre mutación, migración, selección y deriva (Wright, 1978). El estudio de la estructura genética de poblaciones es esencial para entender y predecir los efectos genéticos en la evolución de las mismas. Además, estos estudios han recibido una mayor atención recientemente debido a su importancia dentro del área de la biología de la conservación para la cual la dinámica poblacional y la variabilidad genética son de especial interés. Para algunas aplicaciones como la comparación de niveles de heterocigosidad interpoblacional o para probar la ventaja selectiva de una proteína, la electroforesis de enzimas es sin duda la técnica más práctica. Pero, para algunos problemas como la estimación del tamaño efectivo de la población (ver Lande y Barrowclough, 1987), el dilucidar si existe un aislamiento reproductivo entre poblaciones, estimar los niveles de entrecruzamiento (Fritsch y Rieseberg, 1992), estudiar las relaciones de parentesco (Philbrick, 1993) y el relacionar las distancias genéticas con características geográficas (de la Cruz et al., 1995) o funcionales (Whitty et al., 1994) al parecer los RAPDs han sido más prácticos y eficientes. Las enzimas son uno de los métodos más frecuentemente utilizados para analizar la estructura genética de las poblaciones debido a que presentan loci codominantes, pero en los casos en que hay poca variabilidad genética, los RAPDs son más adecuados (Mosseler et al, 1992) ya que han detectado una mayor variación que las enzimas (ver cuadro 5) . En muchas especies el éxito reproductivo femenino (medida de la adecuación en función de la reproducción) puede estimarse de manera sencilla por medio de la producción de semillas. Por el contrario, el éxito reproductivo masculino es sumamente difícil de asignar ya que la descendencia no puede


ser asociada directamente con el progenitor masculino. Pese a esto, el éxito reproductivo masculino es un componente importante de la adecuación y su estimación es de gran interés en biología evolutiva. A pesar de su dominancia, los RAPDs tienen la ventaja de presentar un número mayor de loci que los que pueden obtenerse con enzimas, esto aumenta su capacidad para estimar la probabilidad de asignación de paternidad. Si el tamaño de muestra es pequeño y se requiere un alto grado de exclusión, probablemente un marcador codominante nos de mayor información, pero conforme aumenta el tamaño de muestra algunos autores han sugerido que los RAPDs pueden ser una mejor opción (Lewis y Snow, 1992; Milligan y McMurry, 1993). Hibridización interespecífica

La identificación de especies híbridas permite inferir las rutas evolutivas seguidas por las especies involucradas en estudios posteriores de filogenia molecular ya que elimina la posibilidad de confusión de resultados en la interpretación de análisis cladísticos. Estos estudios también son importantes porque sientan las bases para investigaciones a nivel poblacional del impacto de la hibridización en la integridad de las especies paternas. Los RAPDs han sido utilizados para identificar individuos de origen híbrido en diferentes familias (cuadro 6). Se han utilizado diferentes técnicas para la identificación de híbridos. Sin embargo, el análisis directo del ADN ha dado los resultados más satisfactorios para detectar hibridación vegetal. Los RAPDs se han preferido a otro tipo de marcadores moleculares gracias a la gran variación que detectan (Smith et al., 1996). A pesar de que la variación detectada por RAPDs no siempre puede inferirse como el resultado de polimorfismo para un loci específico, estudios de segregación muestran que una gran proporción de estos marcadores pueden ser considerados como caracteres mendelianos (Williams et al., 1990; Bucci y Menozzi, 1993) y que son heredados como dominantes (Williams et al, 1990). Estas características son críticas para la detección de hibridación interespecífica (Smith et al., 1996). Identificación y relaciones genéticas de cultivares y variedades

Desde que Welsh et al., (1991) mostró que los RAPDs son una técnica eficiente para identificar genéticamente híbridos de maíz, se han utilizado ampliamente para identificar cultivares, variedades e híbridos (cuadro

4), así como para revelar los grados de diversidad genética entre cultivares y razas (cuadro 7). El conocimiento de la variación genética intra- e inter-específica y de las relaciones genéticas entre colecciones, variedades, poblaciones y especies de plantas silvestres y cultivadas es fundamental para diversas aplicaciones. En los programas de entrecruzamiento de plantas, las estimaciones de las relaciones genéticas entre cultivares pueden ser útiles para la organización del germoplasma, la identificación de cultivares, la selección de progeQitores para la conducción de hibridizaciones y la reducción del número de colecciones necesarios para asegurar el muestreo de un amplio intervalo de la variabilidad genética (Thormann et al., 1994). Estos marcadores también son útiles para determinar los sitios de domesticación y origen de cultivos (e.g., de la Cruz et al., 1995; Hilu y Stalker, 1995) . Al parecer, los RAPDs como marcadores para identificar cultivares y sus parientes silvestres son sensibles al grado de diferenciación genética entre las entidades bajo estudio. Se ha demostrado que se requieren muy pocos oligonucleótidos para distinguir cultivares con propagación vegetativa (Koller et al., 1993; Harada et al., 1993) o con un alto grado de autofecundación (Dweicat et al., 1993, 1997; Mercado et al., 1996) y muchos cuando la diferenciación ha sido muy alta o con polinización cruzada (Zain et al., 1944; de la Cruz et al., 1995). Análisis filogenético

En la actualidad ya existen muchos estudios filogenéticos con RAPDs (cuadro 8). La utilidad de los RAPDs para diferentes niveles taxonómicos fue investigada en ]uniperus por Adams y Demeke (1993) quienes encontraron que algunos oligonucleótidos amplifican segmentos de ADN muy conservados que pueden ser utilizados para detectar polimorfismo en niveles superiores de clasificación (subgénero: Caryocedrus, ]uniperus y Sabina), mientras que otros oligonucleótidos amplifican ADN sumamente variable adecuado para la clasificación y análisis a nivel de especies. El estudio de Wilkie et al. (1993) demostró que el análisis con los marcadores RAPDs puede ser utilizado para estudiar las relaciones filogen éticas entre especies cercanas. Whitty et al. ( 1994) mostraron el potencial de los RAPDs para separar el género de Chamaecrista (fijadores de nitrógeno) de grupos previamente congenéricos de Cassia y Senna. Encontraron una coincidencia de la variación genética con la localización geográfica para dos especies de Chamaecrista y una gran consistencia de la variación genética con la observada para 93


Cuadro 4. Listado de trabajos en los que se han utilizado los RAPDs como marcadores moleculares para la identificación genética a nivel infraespecífico.

Familia

Actinidiaceae Amaranthaceae Annonaceae Asteraceae

Convolvu laceae Cruciferae Cucurbitaceae Ericaceae Euphorbiaceae Gesneriaceae Gramineae

Legumin osae

Leguminosae y Gramineae Liliaceae Malvaceae Moraceae Musaceae Myrtaceae Palmae Pinaceae

Especie

94

Referencia

Actinidia spp. Amaranthus spp. Annona spp. Dendranthema grandiflora D. grandiflora Ozothamnus diosmifolius lpomea batatas Brassica napus B. oleracea var. capitata Citrullus lanantus Vaccinium macrocarpon Euphorbia pulcherrima Cyrtandra spp. Agrostis sto/onifera Arrhenatherum elatius Buchloe dactyloides Oryza sativa

Cultivares y espec ies Espec ies Cultivares Cultivares Clones Indi v iduos Cultivares Cultivares Cultivares Cultivares Variedades Cultivares Híbridos interespecíficos Cultivares Genets Cultivares Cultivares

Oryza spp.

Su bespec ies

Sacharum officinarum Seca /e cera /e Cajanus spp., Rhynchosia spp., Dunbaria ferruginea y Flemingia stricta Glycine max C. max Lolium spp. y Festuca spp . Mangifera indica Medicago coerulea, M. fa/cata y M. sativa M. coeru lea, M. fa /cata y M. sativa Phaseolus vulgaris Pisum sa tivum Glycin e max y Zea mays Lilium spp. Zantedeschia spp. Gossypium hirsitum y C. barbadense Ficus ca rica Musa spp. Eucalyptus spp.

1ntraclonal Cultivares Especi es

Cipriani et al. (1996) Transue et al. (1994) Ronning et al. (1995a) Wolff et al. (1995) Wolff (1996) Ko et al. (1996) Connol ly et al. (1994) Mailer et al. (1994) Phippen et al. (1997) Lee .e t al. (1996) Novy et al. (1994) Li ng et al. (1997) Smith et al. (1996) Golembiewski et al. (1997) Miller et al. (1996) Wu y Lin (1994) Fukuoka et al. (1992), Virk et al. (1995) Mackill (1995) y Martin et al. (1997) Taylor et al. (1995) lqbal y Rayburn (1994) Ratn apa rkh e et al.' (1995)

Semillas Cultivares Especies Cultivares y proge ni e F1 Muta ntes meióticos

Shatters et al. (1995) Jianhu a et al. (1996a) Wiesner et al. (1995) Sch nel 1 et al. (1 995) Barcaccia et al. (1 994)

Híbridos interespecíficos

Barcaccia et al. (1995)

Cu ltivares Cu lti vares In div idu os (semi ll as) Espec ies, híbridos y cultivares Cultivares Cultivares

Johns et al. (1997) Samec y Nasinec (1995 y 1996) Jianhua et al. (1996b) Yamagishi (1995) H amada y H agimori (1996) Multani y Lyon (1995)

Variedades Cult ivares y espec ies Genets Cu lti vares Genets

Khadar i et al. (1995) Bh ar et al. (1995) Kei l y G riffin (1994) Corniq uel y Mercier (1994) Heinze y Schmidt (1995) y Scheepers et al. (1997) Khasa y D anc ik (1996) Perron et af. (1995) Aagaard et al. (1995) Martín y Pérez (1994) G id oni et al. (1994) Pare nt y Pagé (1995) Tancred et al. (1 994) Dunemann et al. (1994)

Phoen ix dacty lifera

Picea abies P. glauca y P. engelmannii P. mariana y P. rubens

Plumbaginaceae Rosaceae

Nivel taxonómico

Pseudotsuga mienziesii Limonium estevei Fragaria ananassa Fragaria sp. Malus domestica Malus spp.

Especies Especies e híbridos Razas Clones Culti vares Cu ltivares Variedades Especies y cultivares


Familia

Rutaceae Sa li caceae

Sap indaceae Sc rofu1ari aceae So lanaceae

Umbe lacaceae Vitaceae

Especi e

N ivel tax onómico

Ya ng y Sc hmidt (1 994)

Mutantes en híb ridos interespecíficos Cu ltiva res Cultivares Cul tivares Genets Cu ltivares Clones Muta ntes Genets Clones Ge nets

Lu Z.-X. et al. (1 996) Lanh am et al. (1995) Ga ll ego y Martínez (1996) Eri ksso n & Bremer (1993) Parent et al. (1993) Sugawa ra et al. (1995) Deng et al. (1995) Castiglione et al. (1993) Lin et al. (1994) Sigurdsso n et al. (1995)

Genets Clones Clones Híbri dos somáticos Híbridos somáticos

Amarger y Mercier (1995) Gavidia et al. (1996) Boga ni et al. (1996) De Filipps et al. (1996) Rokka et al. (1994)

Cul tiva res

Mori et al. (1993) y Hosaka et al. (1994) Kae ndler et al. (1996) Xu et al. (1993) MaafS y Klaas (1995) Regner y Messner (1993) Moreno et al. (1995)

Prun us cerasus y P. ca nescens P. persica Ribes nigrum Rosa sp. Rubus saxatilis Rubus spp. Citrus sp. Citrus sp. Populus spp. Populus spp. P. trem ula y P. trichocarpa Simmondsia chinensis Digita lis obscura Lycopersicon esculentum Nicotia na spp. Solanum brevidens y S. tuberosum S. tuberosu m S. tuberosum y S. papita S. tuberosum y S. brevidens A llium sativum Vitis vinífera V. vinífera

Híbrido~ somáticos Híbri dos somát icos Cultivares Cul tivares Clones y culti vares

la estructura del nódulo. Sus resultados muestran el potencial de los RAPDs para examinar caracteres genéricos, específicos y funcionales. Algunos autores han explorado la capacidad de los RAPDs para inferencias filogenéticas usando métodos de parsimonia (Backeljau et al., 1995; Rieseberg, 1996) . La presencia compartida de un fragmento comparable de RAPDs puede usarse como estados de carácter en el análísis filogenético de parsimonia aunque se requiere necesariamente que los productos de amplificación (bandas de RAPDs) sean homólogos, independientes y variables. Se han reportado ineficiencias para este propósito debido a que presentan algunos problemas conceptuales p lanteados por Backeljau et al. (1995): i] los métodos de parsimonia carecen de un modelo apropiado para el estado de cambio de carácter de los RAPDs, ii] la interpretación alélica de los RAPDs es equivalente al modelo de alelos independientes para aloenzimas y es por lo tanto, inválida y iii] la sospecha de que las regiones de alineación ricas en GC están sesgadas, lo cual podría aumentar la frecuencia de homoplasia e incrementar el multialelismo. Por su parte, Rieseberg (1996) señala algunas consideraciones impor tantes: i] la presencia/ausencia de las bandas de RAPDs puede depender de la presencia/ ausencia de

Referencia

otros productos amplificables, ii] diferentes bandas de RAPDs pueden tener pesos moleculares similares y ca-migrar en los geles y iii] algunos o ligonucleótidos pueden producir bandas diferentes a pesar de que un análisis con enzimas de restricción (RFLPs) (ver M. Martínez, este número) muestren lo contrario. Catalán et al. (1995) mostraron que existe homología en las bandas co-migrantes entre especies cercanas (infragenérico), pero que no hay homología cuando se comparan especies más distantes. Ellos sugieren probar la extensión taxonómica de la homología para estudios filogenéticos con estos marcadores. Para probar la homología entre fragmentos de RAPDs en tres especies de girasoles del género Helianthus, Rieseberg ( 1996) analizó 220 fragmentos de los cuales el 91 % resultaron ser homólogos indicando que la similitud en el tamaño del fragmento es un buen indicador o predictor de homología, al menos entre especies estrechamente relacionadas.

Biología de la conservación Uno de los problemas que ha recibido una gran atención en los últimos años es el deterioro de los ecosistemas naturales y como consecuencia de esto, la disminución de la biodiversidad . En el área de la

95

ADRIANA ÜTERO ARNAIZ, MARLENE DE LA CRUZ y KEN ÜYAMA

Cuadro 5. Estudios de variación y estructura genética de poblaciones que utilizan RAPDs como marcadores moleculares.

Familia Alstroemeri aceae Araliaceae Asteraceae

Chenopodiaceae

Cruciferae Di pteroc arpaceae Ericaceae Gesneriaceae Gramineae

Lactucaceae Leguminosae

Malvaceae Moraceae Myrtaceae Palmae Pin aceae

Polygonaceae Proteaceae Rosaceae Rubiaceae Salicaceae

Sapindaceae Stercu 1iaceae

Umbelacaceae

96

Especie

Alstroemeria spp. Panax quinquefolius Argyroxiphium sandwicense Cynara scolymus Microseris douglasii ··Beta vulgaris Salicornia spp. y Arthrocnemum macrostachyum Brassica napus Shorea spp . Vaccinium macrocarpon Orobanche aegyptiaca y O. crenata Buchloe dactyloides Panicum virgatum Poa annua Sorghum bicolor Lactoris fernandeziana Clicine max Cliricidia sepium y C. maculata Lablab purpureus Medicago truncatula Phaseolus vulgaris P. vulgaris Trifolium pratense Vicia pisiformis lliamna corei y l. remota Humulus lupulus Eucalyptus globulus Picea abies Elaesis guineensis Pinus spp. P. sylvestris Pseudotsuga menziesii Fagopyrum esculentum Crevil/ea scapigera Prunus americana . Coffea arabica Populus tremuloides P. tremuloides P. tremuloides y P. grandidentata P. tremuloides Simmondsia chinensis Theobroma cacao T. cacao T. cacao Allium aaseae y A. simillimum

Referencia Anastassopoulos y Keil (1996) Bai et al. (1997) Friar et al. (1996) Tivang et al. (1996) Roelofs y Bachmann (1995) Lorenz et al. (1994) Luque et al. (1995) Hal ldén et al. (1994) Harada et al. (1994) y Novi et al. (1 996) Steward y Excoffier (1 996) Paran et al. (1 997) Peakall et al. (1995) Gunter et al. (1996) Sweeney y Danneberger (1995) Menkir et al. (1997) Brauner et al. (1992) Helms et al. (1997) Chalmers et al. (1992) Liu (1996) Bonnin et al. (1996) Haley et al. (1994c) Skroch y Nienhuis (1995 b) Kongkiatngam et al. (1995, 1996) Gustafsson y Gustafsson (1994) Steward y Porter (1995) Pillay y Kenny (1996) y Brady et al. (1 996) Nesbitt et al. (1995) Bucci y Menozzi (1995) Shah et al. (1994) Mosseler et al. (1992) Szmidt et al. (1996) Aagaard et al. (1995) Kump y Javornik (1996) Rossetto et al. (1995) Gogorcena y Parfitt (1 994) Lashermes et al. (1996) Tuskan et al. (1996) Yeh et al. (1995) Liu y Furnier (1993) Chong et al. (1994) Amarger y Mercier (1995) Whitkus et al. (1 997) N'Goran et al. (1994) Rusell et al. (1993) Smith y Pham (1996)


biología de la conservación, uno de los problemas relevantes es el estudio de organismos raros, endémicos o en peligro de extinción. Aunque existe una polémica con respecto a la relevancia de los componentes ecológicos o genéticos en los enfoques poblacionales de conservación (Lande 1988; Oyama, 1993), sin duda el uso de técnicas de PCR en general, ofrece la oportunidad de obtener información genética a partir de poco material orgánico para resolver problemas de conservación en poblaciones pequeñas (Amos y Hoelzel, 1992). Existen algunas especies en donde la variación detectada con enzimas es poca o nula y utilizando RAPDs se ha podido detectar polimorfismos y describir su estructura genética (Mosseler et al., 1992). Este es el caso de especies clonales, raras o de distribución muy restringida o que han experimentado disminuciones drásticas en su distribución y abundancia (Brauner et al., 1992; Mosseler et al., 1992; Gustafsson y Gustafsson, 1994; Rossetto et al., 1995; Stewart y Porter, 1995; Friar et al., 1996; Tuskan et al., 1996). El caso de una especie rara en donde se encontró un nivel de variación menor que el de otros géneros endémicos de la misma región es Lactoris fernandez.iana (Brauner et al., 1992). Este arbusto es poligamodioico y es el único representante vivo de la familia Lactoridaceae que es una familia muy primitiva de angiospermas. Su distribución se restringe a una isla del Archipiélago Juan Fernández de la costa de Chile. Esta planta es extremadamente rara y los análisis enzimáticos no revelaron variación genética (Crawford et al., 1991) . Para Lactoris el polimorfismo fue detectado con 16 oligonucleótidos que produjeron 106 bandas de las cuales 26 fueron polimórficas para un total de 27 plantas de 15 poblaciones (Brauner et al., 1992). Un caso interesante es el estudio de Allium aaseae (Alliaceae), una especie endémica de distribución restringida, en donde se detectaron niveles de variación genética con RAPDs comparables a especies de amplia distribución (Smith y Pham, 1996). Existen varios casos en la literatura en donde plantas raras o endémicas con distribuciones restringidas muestran mayor variació!l que sus congeneres con mayor amplitud de distribución (Karron 1987, 1991; Hamrick y Godt, 1990; Ranker, 1994; Lewis y Crawford, 1995). Estos resultados van en contra de lo esperado teóricamente por lo que resulta interesante la exploración de hipótesis alternativas. Fenómenos tales como procesos de especiación recientes, cambios recientes en los patrones de distribución geográfica (Karron et al., 1988), múltiples efectos de colonización (Ranker, 1994) o refugios del Pleistoceno (Lewis y Crawford, 1995) han sido planteados en la literatura. De esto, podemos concluir que el re-análisis de los patrones

de variación genética con otros marcadores moleculares puede cambiar las interpretaciones de las posibles causas del origen de especies raras o endémicas restringidas, que a su vez pueden tener implicaciones importantes para fines de conservación. Métodos de análisis

Al analizar los datos obtenidos con RAPDs se deben tener_en cuenta dos supuestos importantes: 1] cada uno de los marcadores representa un locus mendeliano en el cual el marcador visible, el alelo dominante, está en equilibrio de Hardy Weinberg con un alelo recesivo y 2] los alelos marcados para diferentes loci no comigran a la misma posición en el gel (Lynch y Milligan, 1994). A pesar de que los heterócigos no pueden ser detectados directamente con los RAPDs, es posible estimar parámetros de la estructura poblacional. Sin embargo, el poder estadístico de estas estimaciones es reducido en comparación a los sistemas codominantes. Pero se pueden obtener estimadores de la diversidad genética cuando nuestras interpretaciones incluyen un cuidadoso seguimiento de los supuestos y se utilizan sólo los loci con las frecuencias alélicas recomendadas por Lynch y Milligan ( 1994). Algunos trabajos que muestran la aplicación de estos métodos son Aagaard et al. (1995), Friar et al. (1996) y Smith y Pham (1996). Un análisis molecular de varianza (AMOVA) de las frecuencias de las bandas puede asignar la estructura genética de poblaciones diploides en equilibrio Hardy-Weinberg o con un nivel alto de autofecundación (Steward y Excoffier, 1996). Este método estima índices de fijación similares a los obtenidos con datos codominantes comparables a los estimadores obtenidos con enzimas usando el método de Weir y Cockerham ( 1984) y con datos moleculares de RFLPs, secuencias de ADN o microsatélites (Excoffier et al., 1992). Una alternativa para estimar la diversidad genética sin la suposición de un equilibrio Hardy-Weinberg es considerar la diversidad fenotípica de las bandas de cada individuo como un genotipo distinto y estimar las similitudes y diferencias con base en las mismas (Huff et al., 1993; Whitkus et al., 1997). Para estudios de diferenciación y relaciones genéticas se utilizan medidas de similitud y de diferencias. La distancia genética puede estimarse como el número de diferencias dividido entre el total de comparaciones. Esto bajo el supuesto de que hay un gran número de loci marcados aleatoriamente por los RAPDs distribuidos a lo largo del genoma, de tal forma que la proporción de diferencias encontradas para estos loci será una buena medida de las diferencias entre los genomas.

97

ADRIANA ÚTERO ARNAIZ, MARLENE DE LA CRUZ Y KEN ÜYAMA

Cuadro 6. Estudios de introgresión, segregación y flujo génico en donde se han utilizado los RAPDs como

marcadores moleculares. Familia

Especie

Objetivo

Nivel de organización Referencia

Agavaceae

Agave schottii

Poblaciones clonales

Annonaceae Asteraceae

Annona cherimol/a Helianthus annus, H. petiolaris y H. anomalus H. anus y H. petiolaris Betula alleghaniensis B. pendula Brassica napus y B. campestris B. napus y B. campestris B. carinata

Niveles de entrecruzamiento Segregación lntrogresión

lntrogresión Segregación Segregación y parentesco 1ntrogresión

B. napus y B. juncea B. oleracea

lntrogresión Segregación

Betulaceae Cruciferae

Datiscaceae Ericaceae

Gramineae

Poa pratensis T. T. T. T.

aestivum aestivum aestivum spelta

T. aestivum y Seca /e cerea/e

Híbridos intPrespecíficos Población Individuos Híbridos interespecíficos

Riesberg et al. (1996) Roy et al. (1992) Akerman et al. (1995) Marshall et al. (1994)

ntrogresión

Híbridos interespecíficos Mikkelsen et al. (1996)

lntrogresi ón

Híbridos somáticos

zamiento lntrogresión Segregación Segregación e introgresión Segregación y niveles de entrecruzamiento lntrogresión lntrogresión lntrogresión lntrogresión lntrogres ión

Los estimadores de distancia genética utilizados son e l índice de Jaccard (Vierling y Nguyen, 1992) , el índice de diversidad de Shannon (Russell et al., 1993) coeficiente de similitud de Dice (Hilu y Stalker, 1995) y la distancia genética de Rogers (Wilkie et al., 1993), de Nei (Aagaard et al., 1995) y la de Nei y Li (Stewart y Porter, 1995). Debido a que existen varias razones posibles para la ausencia de un fragmento, el uso de coeficientes que omitan la consideración de datos negativos (e.g.,Jaccard o Dice) pueden ser más apropiados. Las distancias genéticas pueden ser utilizadas para un análisis de clusters (UPGMA) y/ o para un análisis de componentes principales para revelar las afinidades genéticas.

98

Población Ronning et al. (1995a) Híbridos interespecíficos Rieseberg et al. (1995)

1

B. oleracea var. botrytis Niveles de endogamia Niveles de entrecruDatisca glomerata Vaccinium darrowi y V. corymbosum V. macrocarpon Pennisetum spp.

Trame et al. (1995)

Mukhopadhyay et al. (1 994) Híbridos interespecíficos Frello et al. (1995) Variedades (progenie Kearsey et al. (1996) doble-haploide) Cultivares (híbridos Fl) Boury et al. (1992) Poblaciones Fritsch y Rieseberg (1992) Híbridos interespecíficos Qu y Hancock (1995) Progenie Fl Especies

Novy y Vorsa (1 996) Gustine et al. (1996)

Población

Huff y Bara (1993)

Progenie F3 Especie Híbridos Líneas isogénicas cercanas (progenie F2) Especies

Francis et al. (1995) lqbal y Rayburn (1995) King et al. (199 3) Schachermayr et al. (1995) Koebner y Martin (1994)

Ventajas y desventajas de los RAPDs como marcadores moleculares Para el uso de los RAPDs es importante considerar sus ventajas y desventajas con respecto a otros marcadores moleculares. En secciones anteriores ya se han mencionado algunos problemas conceptuales concernientes a la interpretación de los resultados de los fragmentos de los RAPDs (e.g., homología de caracteres). La electroforesis de enzimas es económica, rápida y los protocolos son relativamente sencillos. Sin embargo, diferentes tejidos o muestras congeladas durante diferentes periodos y bajo diferentes condiciones en ocasiones presentan diferentes patrones de bandeo, así como muestras colectadas en diferentes


Familia

Legumin osae

Moraceae Pin aceae

Especie

Objetivo

Nivel de organización

Zea mays

lntrogresión

Especies

Z. mays

Segregación

Arachis hypogaea y A. cardenasii Arachis spp. Cliricidia spp. Medicago sativa Humulu s lupulus Picea abies

ntrogres ión

1

Referencia

Gou rmet y Rayburn (1996) Poblaci ón (segregación Heun y Helentjaris (1993) en 2 generaciones) Híbridos interespecífi cos García et al. (1995)

lntrogresión Fluj o géni co Ni veles de entrecruzamiento Segregación Segregac ión

Proge nie F2 interespec ifico Individu os

García et al. (1996) Dawson et al. (1996) Gjuric y Smith (1996)

Progen ie Fl Población

Pillay y Kenny (1996) Bucci & Menozzi (1993) Carlson et al. (1991)

1

P. glauca y Pseudotsuga menziesii Pinus sylvestris

Segregación

Progenie Fl

Segregación

Pseudotsuga menziesii

Segregación

Malus floribunda y M. domestica Malus spp. Prunus persica Coffea arabica y C. canephora Solanum tuberosum y S. bulbocasta num S. tuberosum y S. p hureja So lanum spp.

lntrogresión

Progenie Fl (tejido hap loide y diploide) Población (tres generaciones) Especie

Parentesco Segregación lntrogresión

Cultivares Población Especie

ntrogresión

Híbridos somáticos

lntrogresión Segregación

Stercu 1ariaceae

Theobroma cacao

Segregación

Híbridos interespecíficos Waugh et al. (1992) Quiros et al. (1993) Híbridos interespecíficos Ronning et al. (1995b) Cultivares

Umbelacaceae

Allium spp .

lntrogresión

Espec ies

Rosaceae

Rutacea e So lanaceae

1

estaciones pueden también mostrar una expresión diferencial de ciertas enzimas. Si se siguen procedimientos adec uados de colecta y de congelado la mayoría de estos problemas pueden ser controlados. El mayor factor limitante de las enzimas es el bajo nivel de variabilidad que detectan. Esto reduce su utilidad sobre todo a nivel intrapoblacional (e.g., Amos y Hoelzel, 1992). Los RAPDs detectan una gran variación, además el an álisis directo del ADN es comparable entre tejidos, no presenta variabilidad estacional y requiere de pequeñas cantidades de ADN. Los marcadores de ADN ofrecen una mayor resolución y flexibi lidad que la electroforesis de enzimas, además se pueden combinar diferentes técnicas . El principal factor limitante de estos marcadores son el

Lu et al. (1995) Jerm stad et al. (1994) Durham y Korban (1994) Gardiner et al. (1996) Pooler y Scorza (1995) Orozco-Casti ll o et al. (1994) Masuelli et al. (1995)

van Raamsdonk et al. (1997)

tiempo y el costo. Algunas de las ventajas que presentan los RAPDs sobre otros marcadores moleculares como los RFLPs y minisatélites, son el que es un método relativamente fácil, que no requiere de un conocimiento previo de la secuencia de ADN, no requieren de la construcción o el mantenimiento de una librería genómica, el número de loci que pµ eden ser examinados es ilimitado y no requieren de pruebas radiactivas (Reiter et al., 1992; Whitkus et al., 1994). Además, los RAPDs revelan altos niveles de polimorfismo dentro y entre poblaciones de especies en comparación con los niveles detectados con RFLPs o isoenzimas (van Heusden y Bachmann, l 992a, b). A continuación se describen brevemente algunos casos que muestran la eficiencia de los RAPDs como

99

ADRIANA ÜTERO ARNAIZ, MARLENE DE LA CRUZ Y Kf.N ÜYAMA

Cuadro 7. Estudios en los que se han utilizado los RAPDs como marcadores moleculares para establecer diferenciación y relaciones genéticas entre cultivares y/o variedades. Familia

Especie


Amara nth aceae Anacardi aceae Araliaceae Asteraceae

Amaranthus spp. Pistacia vera Panax quinquefolius Cynara scolymus Microseris douglasii M. pygmaea

Cultivares Cultivares Cultivares Cultivares Poblaciones Poblaciones

Caryophyl laceae Convolvulaceae Cruciferae

Si/ene latifolia lpomea batatas Brassica juncea B. napus B. oleracea var. capitata B. oleracea Capsel/a bursa-pastoris Citrullus lanantus Vaccinium macrocarpon V. macrocarpon Manihot esculenta Euphorbia pulcherrima Avena sterilis Buchloe dactyloides Echinochloa spp. Hordeum vulgare Lolium perene Oriza sativa O. sativa

Cultivares y Razas Cultivares Cultivares Cultivares Cultivares Variedades Poblaciones Cultivares Variedades Cultivares Cultivares Cultivares Cultivares Cultivares Cultivares Cultivares Cultivares Variedades Cultivares

O. sativa Panicum spp. P. virgatum Poa pratensis Sacharum spp. Sorghum bicolor Triticum aestivum, Hordeum vulgare y Avena sativa T. aestivum T. aestivum T. monococcum y T. urartu T. uratu Cajanus cajan Chamaecytisus proliferus ssp. pa/mensis Cliricidia sepium y C. maculata Clycine max. Lens spp.

Poblaciones Especies Poblaciones Cultivares Especies Líneas puras Cultivares

Transue et al. (1994) Hormaza et al. (1 994a) Bai et al. (1997) Tivang et al. (1996) Roelofs y Bachmann (1995) van Heusden y Bachmann (1992a, b) y van Houten et al. (1994) Vel lekoop et al. (1996) Connolly et al. (1994) Jain et al. (1994) Mailer et al. (1994) Phippen et al. (1997) Dos Santos et al. (1994) Neuffer (1996) Lee et al. (1996) Novy et al. (1994) Novi y Vorsa (1995) Marmey et al. (1993) Ling et al. (1997) Heun et al. (1994) Wu y Lin (1994) Hilu (1994) Ordon et al. (1997) Huff (1997) Xiao et al. (1996) Yu y f'~guyen (1994), Virk et al. (1995), Mackill (1995) y Loarce et al. (1996) Suh et al. (1997) M'Ribu y Hilu (1994) Gunter et al. (1996) Huff y Bara (1993) Huckett y Botha (1995) Vierling et al. (1994) Dweikat et al. (1993)

Variedades Cultivares Cultivares Poblaciones Cultivares y poblaciones Poblaciones

Joshi y Nguyen (1993) Mercado et al. (1996) Vierling y Nguyen (1992) Castagna et al. (1 997) Ratnaparkhe et al. (1995) Francisco-Ortega et al. (1993)

Poblaciones

Dawson et al. (1996)

Poblaciones Cultivares

Lens spp. Lolium spp . y Festuca spp. Mangifera indica Medicago truncatula Phaseolus lunatus

Poblaciones Especies Cultivares Poblaciones Cultivares

Helms et al. (1997) Abo-e lwafa et al. (1995) y Ahmad et al. (1996) Sharma et al. (1995) Wiesner et al. (1995) Schnel 1 et al. (1995) Bonnin et al. (1996) Nienhuis et al. (1995)

Cu cu rbitaceae Ericaceae Euphorbi aceae Gramineae

Leguminosae

100

Referencia


Familia

Especie


Referencia

P. vulgaris P. vulgaris

Cultivares Genotipos Cultivares

Johns et al. (1997) Skroch y Nienhuis (1995 a) Samec y Nasinec (1995 y 1996) Lu et al. (1996) Kongkiatngam et al. (1996) Bullita (1995) Link et al. (1995) Dubouzet et al. (1997) Multani y Lyon (1995)

Pisum sativum

Liliaceae Malvaceae

Moraceae Musaceae Myrtaceae

Myrtaceae Palmae Pinaceae Polygonaceae Rosaceae

Rubiaceae

Rutaceae Salicaceae Solanaceae

Stercu lari aceae

Triticaceae Umbelacaceae Umbelacaceae Vitaceae

Pisum spp. Trifolium pratense Trifolium spp. Vicia faba Alstroemia sp. Gossypium hirsutum y C. barbadense C. hirsutum y C. barbadense C. hirsutum. y C. arboreum J/iamna corei e l/iamna remota Ficus carica Humulus lupu/us Musa spp. Eucalyptus globulus E. risdonii y E. amygdalina

Eucalyptus spp. Elaesis guineensis Picea abies Fagopyrum esculentum Fragaria sp. Fragaria X ananassa Malus domestica Malus spp. Malus spp. Margyracaena skottsbergii Prunus persica Prunus spp. Ribes nigrum Rubus spp. Coffea arabica Coffea spp. Citrus deliciosa Populus spp. P. tremuloides Solanum melongena S. chaucha S. tuberosum Theobroma cacao T. cacao ssp. cacao Varias especies

Allium sativum Allium spp. Vitis spp.

Cultivares Cultivares Poblaciones Cultivares Cultivares Cultivares Cultivares y híbridos interespecíficos Variedades Poblaciones e Genets Cultivares Cultivares Poblaciones Cultivares Especies y híbridos interespecíficos Genets Cultivares Poblaciones Poblaciones Cultivares Cultivares Cultivares Cultivares Poblaciones Híbridos Cultivares Cultivares Cultivares Especies Poblaciones Variedades y especies Cultivares Genets Poblaciones Poblaciones Cultivares Cultivares Cultivares Poblaciones Especies Cultivares Cultivares Cultivares

Tatineni et al. (1996) lqbal et al. (1997) Steward y Porter (1995) Khadari et al. (1995) Pillay y Kenny (1996) Bhat et al. (1995) Nesbitt et al. (1995) Sale et al. (1 996) Keil y Griffin (1994) Shah et al. (1994) Scheepers et al. (1 997) Kump y Javornik (1996) Parent y Page (1995) Graham et al. (1996) Gardiner et al. (1996) Harada et al. (1993) Dunemann et al. (1994) Crawford et al. (1993) Warburton y Bliss (1996) Ortíz et al. (1997) Lanham et al. (1995) Graham y McNicol (1995) Lashermes et al. (1 996) Orozco-Castillo et al. (1994) Machado et al. (1996) Castiglione et al. (1993) Yeh et al. (1995) Karihaloo et al. (1995) Cisneros y Quiros (1995) Hosaka et al. (1994) Russel et al. (1993) y N'Goran et al. (1994) de la Cruz et al. (1995) Wei y Wang (1995) Maa~ y Klaas (1995) Wilkie et al. (199 3) Qu et al. (1996)

101


Cuadro 8. Estudios de relaciones filogenéticas en donde se han utilizado los RAPDs como marcadores mole-

culares.

Familia

Caryophyl 1aceae Chenopodiaceae Cruciferae Cupresaceae Geraniaceae Gramineae Leguminosae

Liliaceae Meliaceae Pin aceae Rosaceae Salicaceae Scrofulariaceae Umbe lacaceae

Especies

Si/ene spp. Beta spp. Brassica spp. y Raphanus sativus }uniperus excelsa y J. procera }uniperus spp. }uniperus spp. Pelargonium spp. Brachypodium spp. Hordeum spp. Arachis spp. Cassia, Senna y Chamaecrista Lens spp. Lens spp. Lens spp. Lens spp. Leucaena spp. Lolium spp. y Festuca spp. Lotus spp. Pisum spp. Trifolium spp. Vigna spp. Asphodelus spp. Syringa spp. 8 especies y 4 generas Abies spp. Pinus spp. Malus spp. Rhododendron spp. Rosa spp. Populus spp. Paulownia fortunei, P. kawakamii y P. taiwaniana Allium spp. Allium spp.

marcadores moleculares. Por ejemplo , Reiter et al. ( 1992) construyeron un mapa genético de Arabidopsis thaliana usando RAPDs con poco esfuerzo; con dos trabajadores de tiempo completo en sólo 4 meses , marcaron y mapearon 225 loci. Además, calcularon la eficiencia de mapeo para sus poblaciones y encontraron que los marcadores dominantes pueden ser tan eficientes como los codominantes (e.g., RFLPs) cuando se usan poblaciones recombinantes. Un caso similar, se ha reportado para una especie de pino en donde Chaparro et al. ( 1992 citado en Tingey et al., 1992) crearon 191 marcadores RAPDs en 6 meses facilitando con esto el mapeo genético en esta especie arbórea. Los problemas prácticos detectados con los RAPDs son la presencia de bandas erróneas o artefactos, la replicabilidad de los resultados y la comigración de 102

Referencia

Oxelman (1996) Shen et al. (1996) Thormann et al. (1994) Adams et al. (1993) Adams y Demeke (1993) Adams (1994) Renou et al. (1997) Catalán et al. (1995) Marillia y Scoles (1996) Hilu y Stalker (1995) Whitty et al. (1994) Abo-elwafa et al. (1995) Ahmad et al. (1996) Ahmad y McNeil (1996) Sharma et al. (1996) Harris (1995) Stammers et al. (1995) Campos et al. (1994) Hoey et al. (1996) Bullita (1995) Kaga et al. (1996 b) Díaz-Lifante y Aguinagalde (1995) Marsolais et al. (1993) Ch almers et al. (1 994) Vicario et al. (1995) Furman et al. (1997) Landry et al. (1994) lqbal et al. (1995) Millan et al. (1996) Castiglione et al. (1993) Wang et al. (1994) van Raamsdonk et al. (1997) Wilkie et al. (1993)

bandas. A menudo se pueden producir múltiples fragmentos de RAPDs al amplificar ADN genómico con un sólo oligonucleótido; sin un an álisis genético formal no es posible determinar si dos bandas en el fenotipo de los RAPDs representan dos loci o si son dos alelos distintos de un sólo locus (Whitkus et al., 1994) . En algunos ensayos con RAPDs se ha encontrado que existe "competencia" entre los fragmentos d e estos marcadores (Williams et al., 1993). Se ha observado que los productos finales de la reacción están determinados por competencia entre sustratos, m ás que por el número total de sitios potencialmente disponibles a menos de que ocurra un apareamiento perfecto entre la muestra de ADN bajo estudio y el oligonucleótido (Heun y Helentjaris 1993; Halldén et al., 1996 ). Esto subestima los fragmentos homólogos porque la


presencia o ausencia de una banda particular de RAPOs pudo darse por competencia con otro fragmento polimórfico más que por un cambio en el sitio de acoplamiento del oligonucleótido (Rieseberg, 1996). La mayoría de los oligonucleótidos tienen un alto contenido de GC (50-80%; Bowditch et al., 1993). Este alto contenido de GC implica que las temperaturas de alineación deben ser bajas, dando la posibilidad de alineaciones imperfectas. Para evitar la presencia de bandas erróneas o artefactos provocadas por una alineación no específica es importante verificar que el contenido de GC de los oligonucleótidos no sea elevado (no más del 60%), trabajar con la mayor temperatura de alineación posible (alrededor de 36 º C) y después de la alineación, elevar la temperatura por unos segundos (54 ºC) para evitar alineaciones del oligonucleótido con segmentos que no son 100% homólogos. Aunque se ha estimado que existe un error del 5-10% intrínseco en la repetibilidad de los fenotipos en la técnica de los RAPOs (Weeden et al., 1992), la repetibilidad y confiabilidad de los resultados puede obtenerse si se establecen de manera precisa cada una de las condiciones, tanto de la reacción de amplificación como de la electroforesis. El problema casi inflanqueable de esta técnica para algunas aplicaciones es que la mayoría de los loci son dominantes, por lo tanto los RAPOs dan menos información genética por locus que los marcadores codominantes. Trabajando con organismos clonales o con poblaciones con un alto grado de autofecundidad la dominancia obviamente no presenta ningún problema (Carlson, 1991; Bucci y Menozzi, 1993; Bonnin et al., 1996). Comentarios finales y perspectivas

el conocidos como STS ("Sequence-Tagged-Site") (ver Talbert et al., 1994). Nuevas técnicas basadas en el uso del PCR para ONA fingerprinting se han desarrollado. Uno de ellos es el llamado AFLPs (ver Simpson 1997 este número) los cuales han revelado niveles significativos de polimorfismo al nivel de ADN (Vos et al., 1995). Los primeros estudios utilizando esta técnica han mostrado que los AFLPs son marcadores moleculares robustos y confiables (Becker et_al., 1995; Meksen et al., 1995; Paul et al., 1997). El uso de los métodos de PCR incluyendo los RAPOs y sus modificaciones han sido muy importantes en el estudio de diversos problemas de biología evolutiva y sus aplicaciones en diferentes campos. Sin embargo, es notorio que la mayoría de los estudios se han hecho con plantas cultivadas por lo que en el futuro será necesario realizar más estudios en especies de ecosistemas naturales. Literatura Citada

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Modificaciones al procedimiento estándard de los RAPOS han sido propuestos. Por ejemplo, la utilización de dos oligonucleótidos en lugar de uno amplifica nuevas bandas distintas (no-homólogas) a las generadas en reacciones con un sólo oligonucleótido, lo cual indica que fueron amplificados en regiones distintas del genoma (Hu et al., l 995a). Esta modificación junto con la síntesis de oligonucleótidos más largos (por ejemplo, de 24 bases "24mers") amplifica los fragmentos de RAPOS de manera más específica y confiable. Estos marcadores fueron denominados SCARs ("Sequence Characterized Amplified Regions") por Paran y Michelmore (1992). Otra alternativa es el uso de un par de oligonucleótidos que puedan amplificar sitios específicos de un alelo en un locus de interés en un fragmento de AON. Este método fue denominado ASAPs ("Allele-Specific Associated Primers") (Gu et al., 1995). Otros método alternativo es

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Akerman S., Tammisola J., Lapinjoki S.P., Soderlund H., Kauppinen V., Vihera-Aarnio A., Regina M. y Hagqvist 103


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104

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