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LES RECEPTEURS DE LA SEROTONINE DANS LES TRAITEMENTS DE LA MIGRAINE: ASPECTS NEURONAUX ET VASCULAIRES CHEZ L' HUMAIN.

Isabelle Bouchelet

Département de Neurologie et Neurochirurgie Université McGiIl, Montréal Mars 2000.

Une thèse soumise à la Faculté des Etudes Graduées et de la Recherche pour satisfaire une partie des conditions requises pour obtenir le diplôme de docteur en philosophie.

•

© 2000, Isabelle Bouchefet

1+1

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sen

0-612-69856-4

Canadi

TABLE DES MATIERES

RESUME ET ABSTRACT

2

ABREVIATIONS

7

ORIGINALITE SCIENTIFIQUE ET CONTRIBUTION DES CO-AUTEURS 9 PUBLlCAT~ONS

13

REMERCIEMENTS

17

Chapitre 1

INTRODUCTION

1.1

Chapitre 2

FONDEMENTS ET OBJECTIFS

2. 1

Chapitre 3

Differentiai expression of sumatriptan-sensitive receptors in human 3.1

trigeminal ganglia and cerebral blood vessels Chapitre 4

No contractile effect for S-HT1D and S-HT1 F receptor agonists in 4. 1

human and bovine cerebral arteries Chapitre 5

Selective

expression

of

the

S-HT2B

receptor

in human

trigeminovascular system: novellocalisations in cerebral vessels and

Chapitre 6

vasodilator containing trigeminal neurons

5. 1

RESUME ET CONCLUSIONS

6.1

REFERENCES Annexe

1

PUBLICATION COMPLEMENTAIRE 5-HT7 receptor gene expression in human trigeminal ganglia.

Annexe Il

•

REIMPRIMES

7.1

•

•

A ma faml-Ile , ubique...

2

• RESUME & ABSTRACr

•

,

•

RESUME Deux catégories principales de médicaments antimigraineux affectent les récepteurs de la sérotonine (S-HT): les agonistes des récepteurs S-HT1 8/1 D et les antagonistes des récepteurs S-HT2B/2C, utilisés en traitements symptomatique et prophylactique respectivement. Etudier leur mode d'action pourrait aider à élucider les mécanismes de la migraine. Utilisant des approches moléculaire, pharmacologique, immunocytochimique, et histochimique, nous avons étudié chez l'humain la distribution et le rôle de ces récepteurs dans le ganglion de Gasser (TG) et les vaisseaux sanguins extracérébraux (PV), deux tissus impliqués au premier chef dans la pathologie migraineuse. Nous avons d'abord étudié les mécanismes des traitements symptomatiques dont le chef de file est le sumatriptan, un médicament hautement efficace mais pouvant provoquer des effets secondaires cardiaques. Deux mécanismes ont été suggérés pour expliquer ses propriétés thérapeutiques pendant la céphalée: la contraction des PVet l'inhibition de l'inflammation neurogène des tissus méningés engendrée(s} par la stimulation du TG. Par ailleurs, les effets cardiaques du sumatriptan chez les sujets à risque ont été associes à sa capacité à contracter l'artère coronaire (CA). Pour aider au développement de médicaments plus sélectifs et dépourvus d'effets vasculaires, nous avons déterminé chez l'humain l'identité et la distribution des récepteurs cibles du sumatriptan dans les TG, les PV et les CA. Le sumatriptan ayant une haute affinité pour les trois récepteurs S-HT1 B, S-HT1D et S-HT1 F. nous avons utilisé la transcription réverse et l'amplification par réaction en chaîne (RTPCR) pour les distinguer. Nous avons ainsi montré la distribution non sélective des ARN des récepteurs S-HT1 0 et S-HT1 F dans les TG et des PV humains. tandis que l'ARN du récepteur S-HT1 B est principalement exprimé dans les PV. De plus. les ARN des récepteurs S-HT1 B et S-HT1 F ont été détectés dans la CA. Nous avons alors montré par une étude de réactivité vasculaire in vitro utilisant des agonistes sélectifs des différents récepteurs. que. de ces trois sous-types, seul le

•

récepteur S-HT1 B provoque une contraction des PV. Les agonistes des récepteurs

•

5-HT1D et S-HT1 F pourraient donc être des antimigraineux dépourvus d'effets vasculaires. Ensuite. nous avons étudié les médicaments utilisés en prophylaxie et antagonistes des récepteurs de type 5-HT28 ou S-HT2C. Il a été suggéré que la stimulation de ces récepteurs dans l'endothélium des vaisseaux sanguins cérébraux pourrait induire des migraines via la libération du monoxyde d'azote (NO), une substance vasodilatatrice et nociceptive. Nous avons montré par RT-PCR que l'ARN du récepteur S-HT28 mais pas celui du récepteur S-HT2C est présent dans les vaisseaux sanguins cérébraux. En outre. par RT-PCR et immunocytochimie nous y avons plus précisement localisé le récepteur et qu'il est présent non seulement dans l'endothélium mais aussi dans le muscle lisse vasculaire. Nous avons ensuite examiné la possibilité de la présence des récepteurs S-HT28 et S-HT2C dans le TG. Nous y avons montré que l'ARN du récepteur S-HT2B mais pas celui du S-HT2C y est exprimé, la protéine du premier s'y trouvant dans un grand nombre de neurones. En outre, nous avons montré qu'il est colocalisé avec des substances vasoactives comme le NO ou, dans une moindre proportion, le peptide vasodilatateur associé au gène de la calcitonine (CGRP), suggérant qu'il pourrait en moduler la libération. Cette étude a donc souligné l'importance du récepteur 5-HT28 dans le sytème trigéminovasculaire,mis en évidence de nouvelles localisations et suggéré de nouveaux rôles régulateurs pour ce récepteur. Dans l'ensemble, ces études ont donc distingué les récepteurs qui pourraient être impliqués dans les effets thérapeutiques et secondaires des traitements antimigraineux et donné des indications fonctionnelles pour leur amélioration.

•

•

ABSTRACT Two classes of antimigraine drugs specifically target serotonin (S-HT) reœptors: agonists of the S-HT1 B/1 D receptors and antagonists of the S-HT2B/2C receptors. They are respectively used in symptomatic and prophylactic treatments. The study of their mechanisms of action can assist in bette:- uncovering the mechanisms undertying migraine. Using

molecular,

pharmacological,

immunocytochemica1

and

histochemical

approaches, we have studied the distribution and the role of the S-HT receptors targeted by these medications in human trigeminal ganglion (TG) and extracerebral vessels (PV), two tissues of primary importance in migraine pathology. We first focused our study of symptomatic treatment on sumatripan, a drug which works with high efficacy but can trigger cardiac adverse-effects. Two mechanisms have been suggested to explain its therapeutic effect during migraine headache: the contraction of overty dilated PV and the inhibition of a neurogenic inflammation within meningeal tissues following the stimulation of TG. Sumatripan's cardiac effects have been associated with the contradion of coronary artery (CA) in high-risk patients. ln order ta help develop drugs which minimize such harmful side-effects, we have identified in human the type and distribution of sumatriptan-sensitive receptors in TG, PVand CA. As sumatriptan has a high affinity for the S-HT1B, S-HT1D and S-HT1F receptor subclasses. we used reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RTPCR) to distinguish between them. We have demonstrated the non-seledive distribution of the RNA for the S-HT1 D and S-HT1 F receptors in human TG and sorne PV whereas the S-HT1 B receptor mRNA was mainly expressed in PV. S-HT1 B and S-HT1F receptor RNA have also been deteded in the CA. We then used an in vitro vascular readivity assay with receptor-selective agonists and showed that of these three receptor subclasses. only the S-HT1 B receptor elicits vasoconstriction in PV. Agonists for S-HT1D and S-HT1F could therefore potentially be anti-migraine compounds devoid of vascular adverse-effects. We followed this study by examining the medications used in prophylaxis which are

•

antagonists at either S-HT2B or S-HT2C receptors. It has been suggested that 5

•

stimulation of such receptors in the

~)ndothelium

of cerebral vessels could trigger

migraine via the release of nitric oxide, a compound both nociceptive and vasodilator. We have successfully demonstrated using RT-PCR that the S-HT2B but not the 5HT2C receptor RNA is present in cerebral vessels. We further utilized RT-PCR and immunocytochemistry to preciselv localize the receptor and show its presence not only in the endothelium but also the smooth muscle of cerebral vessels. We then expfored the possibility of the presence of S-HT2B and S-HT2C receptors in TG. We also found that only the S-HT2B mRNA is expressed in this tissue and that the protein product is detected in a large number of neurons. We further showed that the receptor co-Iocalizes with vasoactive substances such as NO and to a lesser extent with the vasodilator calcium gene-related peptide (CGRP). suggesting it might modulate their release. This study presents the importance of the S-HT28 in the trigeminovascular system and shows novel localizations and potential new roles for this receptor. As a whole, these results identity the key receptors critical for the development of effective antimigraine therapies and present new functional clues for the development of new compounds.

•

6

•

LISTE DES ABREVIATIONS

5-CT 5-HIAA 5-HT 8-0H-o-PAT AC ADN AMPc

AMV ARN

BBB bp Ca 2 + CAP CSF CNS CGRP

OAB

OHE 001 EC GABA GMPc GR 127935

IP IS-159

LY334370 LY344864 m-CPP MV NADPH-O NI

NKA

•

NO NTG NTS

5 carboxamidotryptamine acide 5-hydroxyindole acétique 5-hydroxytryptamine, sérotonine 8-hydroxy-2-di-n propylamino-tétraline adénylyl cyclase acide déoxyribonucféique adénosine mono phosphate cycfique virus avien de la myélobtastese acide ribonucléique barrière hématoencéphalique paires de bases calcium capillaire liquide céphalo rachidien système nerveux central peptide associé au gène de la calcitonine diamine benzidine dihydroxyergotamine [1-(2,5-diméthoxy-4-iodophényl)2-aminopropane cellule endothéliale acide gamma amine butyrique guanosine monophosphate cyclique (N-[méthoxy-3-(4-méthyl-1-pipérazinyl)phenyl]-2'-méthyt-4'-( 5méthyl-1 ,2,4-oxadiazol-3-yl)[1, 1-biphényl]-4carboxamide hydrochloride inositol phosphate sérotonine-O-earboxyméthylglycyltyrosinamide 4-fluoro-N-(3-(1-methyl-4-piperidinyl)-1 H-indol-5-yl]-benzamide (R)-( +)-N-{3-dimethylamino-1 ,2,3,4-tétrahydro-9H-carbazol-6yl)-4-fluorobenzamide m-ehlorophényl pipérazine microvaisseau diaphorase du nicotinamide adénine dinucléotide phosphate inflammation neurogène neurokinine A monoxyde d'azote nitroglycérine nucleus tractus solitarius 7

•

PBS PLC PNU-109291 PNU-142633 PPE

PV RT RT-PCR

SM SMC Substance P

TG TGC WAY100635

•

tampon phosphate phospholipase C (S )-(- )-1 [2-[4-{4-méthoxyphényl)-1-pi pérazi nyl]éthyl]-Nméthylisochroman-6-carboxamide (S)-3,4-dihydro-1-[2-[4-(4-méthoxyphényl)-1-pipérazinyl]éthyl]N-méthyl-1 H-2-benzopyran-6-carboximide extravasation des protéines plasmatiques vaisseaux sanguin pie-mérien transcriptase réverse réverse transcription-réaction en chaîne de polymérisation muscle lisse cellule de muscle lisse substance P ganglion de Gasser ou trijumeau nucleus trlgemlncJlr... ceJudulis

N-(2-[4-{2-méthoxy-phényl )-1-pi pérazinyl]éth yi )-N-(2pyridinyl)cyclohexane carboxamide trihydrochloride.

8

• ORIGINALITE SCIENTIFIQUE ET CONTRIBUTION DES CO-AUTEURS

•

9

•

Cette thèse représente une contribution originale à la connaissance des récepteurs de la sérotonine et de leur possible rôle dans la pathologie migraineuse. Les résultats présentés ici ont été publiés ou sont en préparation.

Le premier article intitulé "Differentiai expression of sumatriptan-sensitive 5hydroxytryptamine reœptors in human trigeminal ganglia and cerebral vessels" décrit les expériences de biologie moléculaire que j'ai réalisées pour détermin\~r quels sont les récepteurs de la sérotonine présents dans le ganglion de Gasser et les vaisseaux extracérébraux chez l'humain. Il a été motivé par la théorie de Dr. MA Moskowltz, de l'université Harvard, et son modèle d'inflammation neurogène. Dans cet article,

l'idée d'étudier la distribution des

récepteurs S-HT1 B

(anciennement S-HT1 O~) et S-HT1 0 (anciennement S-HT1 Da) dans les deux tissus a été donnée par le Dr. E. Hamel. J'ai apporté l'idée d'étudier en plus le récepteur S-HT1F. La technique de RT-PCR a été installée dans le laboratoire par le Dr. P. Séguéla. Les tissus humains ont été fournis par le Département de Pathologie de l'Hôpital Royal Victoria. J'ai réalisé toutes les expériences de l'article. Cette étude a montré que les ARNm des deux récepteurs S-HT1 B et S-HT1D sont présents dans le ganglion de Gasser. Dans les vaisseaux extracérébraux, cette étude a confirmé la présence du récepteur 5-HT1 B mais montré aussi la présence du récepteur S-HT1 0 dans certains d'entre eux. En outre, cette étude montre pour la première fois que le récepteur S-HT1 F sensible au sumatriptan mais à la fonction encore inconnue- est présent dans les deux tissus. Ces résultats ont encouragé le développement de nouveaux médicaments antimigraineux agonistes du récepteur S-HT1F.

•

10

•

L'article intitulé" No contractile effect for S-HT1::> and S-HT1 F receptor agonists in human and bovine cerebral arteries: similarity with human coronary artery" est la suite logique du précédent et examine l'effet fonctionnel de la stimulation des récepteurs identifiés préalablement dans les vaisseaux extracérébraux. Cette étude a été realisée suivant une idée du Dr. E. Hamel qui s'est aussi procuré de nouveaux agonistes sélectifs encore non commercialisés. J'ai apporté l'idée de déterminer quels récepteurs du sumatriptan étaient présents dans les artères coronaires

humaines

et

y

pourraient

médier

ses

effets

secondaires

vasoconstricteurs. Dans cet article, j'ai fait toutes les expériences de biologie moléculaire et de réactivite vasculaire, cette dernière étant une technique apprise du Dr. Hamel. Les vaisseaux extracérébraux sont issus de la salle d'opération de l' Hôpital Neurologique de Montréal et fournis par le Dr. Olivier tandis que les artères coronaires ont été fournies par le Dr. Case du Département de Pathologie de l'Hôpital Royal Victoria.

L'article intitulé "Selective expression of the S-HT2B reœptor in human trigeminovascular system: Novel localisations in cerebral blood vessels and vasodilator containing trigeminal neurons" représente une nouvelle perspective de recherche fondée sur les résultats cliniques de certains médicaments utilisés en prophylaxie (hypothèses des Ors. J.R. Fozard et J. Olesen). L'idée d'étudier la présence récepteur S-HT2B dans les vaisseaux est du Dr. E. Hamel. L'idée d'étudier sa présence dans le ganglion de Gasser est venue de moi après des expériences de réactivité vasculaire montrant que la stimulation du récepteur n'induit qu'une vasodilatation mineure.

•

11

•

Les expériences de RT-PCR ont été faites par moi dans les ganglions de Gasser et les vaisseaux extracérébraux et par le Dr. Zvi Cohen dans les vaisseaux intracérébraux et les cellules qui en sont dérivées. Les cellules ont été préparées par Mme. Rita Bali du Conseil National de Recherches du Canada sous la direction du Dr. O. Stanimirovié. Les expériences d'immunohistochimie ont été faites par moi grâce à l'enseignement et la direction du Dr. X.K. Tong. Celui-ci a fait les coupes semi-fines et apporté l'idée d'utiliser des kits de détection en lumière visible pour la colocalisation du CGRP et du récepteur S-HT2B dans le ganglion de Gasser. Les "Western blots dans le cortex cérébral humain ont été faits par le Dr. H. Y. Wang de ft

l'école de médecine MCP- Hahnemann, PA, USA, selon une méthode développée dans son laboratoire. Les tissus ont été obtenus du Département de Pathologie de l'Hëpital Royal Vietoria.

•

12

• PUBLICATIONS

•

13

•

Articles Bouchelet 1., Cohen Z., Case B., Séguéla P. et Hamel E. (1996). Differentiai expression of sumatriptan-sensitive S-hydroxytryptamine receptors in human trigeminal ganglia and cerebral blood vessels. Mo/ecu/ar Pharmaco/ogy 50: 19-23.

Rarnjaun A.R., Micheva K.O., Bouchelet 1. et McPherson P.S. (1997). Identification and characterization of a nerve terminal-enriched amphiphysin isoform. Journal of Bio/ogical Chemistry 272(26): 16700-16706.

Cohen Z., Souchelet L, Olivier A.. Villemure J-G, Bali R., Stanimirovié D. B. et Hamel E. (1999 ) Multiple microvascular and astroglial 5-hydroxytryptamine receptor subtypes in human brain: molecular and pharmacological charaderization. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 19(8): 908-91 7.

Bouchelet 1., Case B, Olivier A. et Hamel E.(2000) No contractile effect of S-HT1D and S-HT1F receptor agonists in human and bovine cerebral arteries: similarity with human coronary artery Brit J Pharmaco/.129: 501-S08.

Ishine T., Souchelet L, Hamel E. et Lee T.J.F.(2000) Serotonin 5-HT7 receptors mediate relaxation of porcine piat veins. Am J Physio/278 (3): H907.

Bouchelet 1., Cohen Z., Tong X-K, Wang H.-Y. et Hamel E.(200Q) Seledive expression of S-HT 28 receptors in the human trigeminovascular system: Novel localisations in cerebral vessels and vasodilator containing trigeminal neurons (en préparation).

Terron J.A., Souchelet 1. and Hamel E. (2000). S-HT7 receptor mRNA expression in

•

human trigeminal ganglia (en préparation). 14

•

Chapitre de livre Bouchelet 1., Cohen Z., Séguéla P. et Hamel E. (1996) Differentiai expression of sumatriptan-sensitive 5-HT1 receptors in human neuronal and vascular tissues. In Migraine. Pharmacology and Genetics ( éditeurs: Sandler M. Ferrari M et Harnett 5)

Chapman and Hall, London, 55-63.

Résumés Bouchelet 1., Cohen Z., Case B., Séguéla P. et Hamel E. (1995). Expression of sumatriptan-sensitive serotonin receptors mRNA in human neuronal and vascular tissues. Soc. Neurosci. Abst. 21 (tome 3): 1853.

Cohen Z., Bouchelet 1., Yong W.V., Villemure J-G, Stanimirovié D. B. et Hamel E. (1995). Differentiai expression of serotonin receptors 5-HT1Da and 5-HT2A mRNA in human brain vessels, vascular calfs and astrocytes in culture. Soc. Neurosci. Abst. 21 (tome 3): 1853.

Bouchelet ,., Case B. et Hamel E.(1996) Expression of mRNA for serotonin (5-HT) in human coronary arteries. Soc. Neurosci. Abst. 22 (tome 2): 1578.

Bouchelet 1., Cohen Z., Stanimirovié D. et E. Hamel (1996). Endothelial5-HT2B, but not 5-HT 2C receptors in human brain vessels: possible raie in migraine headache. Journal of Cerebral S/ood F/ow and Metabolism 17, Suppl. 1: 5351.

Bouchelet 1., Cohen Z., Olivier A., Stanimirovié D. et Hamel E. (1996). Implication de nouveaux récepteurs de la sérotonine dans la prophylaxie et la traitement en phase aigüe de la migraine. 64ème Congrès de l'A CFA S, Montréal. Canada.

•

15

•

Bouchelet 1., Cohen Z., Yang W., Stanimirovié O. et Hamel E. (1996). Molecular basis for a possible raie of serotonin S-HT2B receptors in the aetiology of migraine headache. IBC's International conference: Serotonin receptors, targets for new

therapeutic agents in the Central Nervous System, Philadelphie, USA.

Bouchelet 1., Case B. et Hamel E.(1997} Expression of neuropeptide Y (NPY) and muscarinic acetylcholine (mACh) receptor messages in human trigeminal ganglion.

Soc. Neurosci. Abst. 23 (tome 2): 1491.

Ishine T., Bouchelet 1., Hamel E. et Lee T.J.F. (1999) Serotonin S-HT7 receptors mediate porcine pial vein relaxation. Experimental Biology '99. Washington OC, USA.

Bouchelet 1. et Hamel E. (1999) No functionalS-HT1O and S-HT1F receptors in human and bovine cerebral arteries. Cephalalgia 19 (4): 369.

Ishine T., Bouchelet 1., Hamel E. et Lee T.J-F.(1999) Serotonin S-HT7 receptors mediate relaxation of porcine piat veins. Journal of Cerebral B/ood Flow and

Metabolism 19, Suppl 1: S323.

•

16

• REMERCIEMENTS

•

17

•

Je remercie le Dr. E. Hamel dans le laboratoire de qui j'ai effectué les études décrites ici. Je lui suis reconnaissante pour son ouverture au développement de nouvelles techniques très complémentaires pour répondre aux questions exposées dans cette thèse. Elle a en outre eu l'habileté de se procurer très tôt les nouveaux composés qui ont permis de réaliser les études pharmacologiques. Elle a aussi rendu possible l'obtention de tissus humains, donnant une plus grande signification

à cette étude. Au cours de ces années, Dr. Hamel a été un exemple constant de persévérance dans ses convictions et de détermination dans la poursuite de ses objectifs. Elle a orienté mon travail avec toute sa compétence et sa gentillesse.

Je suis très reconnaissante aux membres du comité de conseil de thèse pour leur intérêt dans mon travail et leurs intéressantes questions et suggestions scientifiques au cours de ces années. Je remercie beaucoup les membres du laboratoire, de l'Institut Neurologique et du Conseil National de Recherches du Canada avec qui j'ai eu le plaisir de travailler. Leur gentillesse, leurs suggestions scientifiques et leurs enseignements ont été très précieux pour moi.

ln particular, 1 would like to thank Dr. XinKang Tong who taught me not only immunocytochemistry but also patiently sorne Chinese words. 1must say that the first was much easier. He was definitely an exceptional teacher, the one who cancels his only holidays to allow me to leam faster, who has patience and skills, can get a broken machine to produce good slices and often develops new and unexpected ways ta extend the use of the material. Without his numerous contributions and the "Chinese connexion" of ail his friends, studying the colocalisation of the weak 5HT2B receptor signal in postmortem tissue would have been impossible.

•

18

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1thank very very much Dr. Maria Jesus Moreno for her teachings and her friendship, the constant support she gave me in the good and the bad moments of this thesis. Her stay in the laboratory was a great chance for us ail. She also gave me the opportunity to meet sorne of her friends who are among the people 1 like and admire most.

Je remercie le Dr. Nathalie Cholet. alias "Super Cholette", dont le dynamisme, la grande gentillesse et la détermination sont appréciés de tous. Sa thèse a été un exemple pour moi et l'occasion de fructueuses conversations sur le monoxyde d'azote, dont le rôle m'était encore peu connu. Enfin, tout le laboratoire a largement profité de tous les chocolats qu'elle distribués depuis son arrivée et qui semblent avoir un effet très positif sur le métabolisme cérébral.

J'ai aussi beaucoup apprécié la compagnie et collaboration de Mme Sylviane Lantin, du futur docteur Jean-Sébastien Aucoin (un représentant remarquable du peuple Québecois) et de Colin Dobson (from "Due South"), ainsi que leur chaleureuse présence au laboratoire.

Je remercie le Dr. Roger Abounader le "roi du pellet" qui nous a tous impressionnés avec son honnêté, ses qualités scientifiques et son aptitude pour les langues. Avec son sens de la compétition et son goût des paris, il a provoqué les moments des plus hilarants de ces années.

Je suis reconnaissante à Mme. Véronica Klein, pour sa compagnie et son assistance au cours des expériences de PCR ainsi que ses grandes capacités de spécialiste des autopsies et des élégances. Ses encouragements, son intelligence et sa bonne humeur ont été très importants au cours de ce travail. Je remercie aussi Mme. Lyne

•

Grégoire avec qui j'ai pris goût à l'immunocytochimie et découvert la présence de neurones à NOS dans le ganglion de Gasser. 19

•

Je remercie le Dr. Nadim Zamar que j'ai eu la chance de rencontrer au début de ma thèse, pour son amitié, ses commentaires scientifiques et ses précieux conseils.

Muchas gracias ta Dr. Antonio Terrén, el Chamaco, for his numerous scientific inputs, his collaboration, his great heart and also the example he gave me on how ta publish, publish, publish ... It was great fun having him in the lab, discussing also with Dr. Mario Alonso about migraine and establishing the precise mapping of the nicest beaches of Mexico. 1 also address many thanks ta Ors. Maria Elisa Calcagnotto and Pedro Rosa for their friendship, their intelligence and the sharing of their medical expertise of neurology and imaging.

During my thesis 1 had the opportunity to teach to a number of "students" who contributed to make the laboratory a very international village. Among them 1would like to aknowledge in particular Dr. Takaaki Ishine, or "Tak" , the nice shogun who visited us ta learn and perform PCR for the pig S-HT7 receptor in a record time. This was quite an experience tirst ta catch the pig and second to catch the gene and was rendered possible by his impressive reliability in the work.

Many thanks to Ors. Ken and Pat Hastings and Holly Bradshaw who extraet "the nicest RNA of the world" and were so helpful teaching me their technique ta get the best out of the postmortem tissue. 1enjoyed their great company and humour and also their capacity to extract the nicest mapte sirup of the world.

1thank Dr. Oanica Stanimirovié who allowed me to develop a project about nitric oxide in her laboratory at the National Research Council of Canada. 1am undebted to her for her intelligent and constructive scientific suggestions, her human qualities

•

and high competence that make her laboratory a leader in the field and a stimulating and friendly environment. In her laboratory 1 thank in particular Dr. Anan

20

•

Muruganandam and Ms. Rita Bali for their teachings.

Je remercie l'équipe si sympathique du centre de recherches de l'Hôpital Douglas où j'ai réalisé des expériences d'hybridation in situ. Je remercie en particulier le Dr. Danielle Jacques qui a consacré beaucoup de temps à superviser mes expériences en dépit de son emploi du temps surchargé. Je lui suis très reconnaissante ainsi qu'aux Ors. Jean-Guy Chabot et Yvan Dumont pour leur grande gentillesse ainsi que leurs nombreux et précieux conseils.

1 thank Dr. Peter McPherson, our neighbour on the 7th floor, for his incredible humour and his dynamic teachings. 1had a great time working in his lab and leaming

trom the persan who learn from the person who leam from the persan who invented the Western blots. 1also thank him and Dr. Wayne Sossin for the example they set and the way they run they labs. 1must say that. in the case of Peter. the ward "run" has a particularty important meaning. Dans son équipe, je remercie particulièrement Ms. Jacynthe Philie pour sa persévérance et son zèle à maintenir vivantes les cultures cellulaires. 1alsa thank particularly Ms. Natasha Hussain for her help in the Western blot experiments. 1 enjoyed ta have as neighbours such a niee team who organizes so many parties to celebrate their so many papers. In the laboratory of Dr. Wayne Sossin, 1thank ail the team and in particular Dr. John Dyer for his teachings about DNAase and his wisdom which 1know now, is the secret of his permanent youth.

Je remercie beaucoup le Dr. A. Beaudet pour ses précieux conseils ainsi que le prët de multiples instruments et matériel. Je remercie chaleureusement Mme. Mariette Houlé qui a été notre ressource constante au cours de toutes ces années et a toujours

su

répondre positivement à la

formule

magique

bien

connue

"DmandchédocteurBeaudet" avec de multiples ressources, protocoles. matériel, et

•

en tous temps, sa bonne humeur. 21

•

Je remercie Mme. Monique ledermann, coordinatrice de notre programme d'études et Mme. Siobhan McCsnn qui m'ont toujours accueiffie avec gentillesse et aidée en de multiples occasions.

1am undebted ta Ms. Sandra Minotti for lending me sa many materiaJs and sharing her expertise in growing orchidées, something 1will not forget when 1get an office of my own.

1thank Dr. Karpati's unit especially Ms. Carol Allen, Ms. Lixia Zhu. and les "frères Guérin", Robert et Claude, for the multiple times they patiently lent me theïr materia!. These were great opportunities to enjoy their company and also to admire their beautiful board dedicated to rats.

Je remercie les Ors. Pascale Krzywkowski et Elvire Vaucher dont j'ai pu admirer aussi bien la grande gentillesse que la rapide carrière scientifique, les Ors. Pierre Villeneuve et Dominique Nouel pour leur enthousiasme et leurs conseils pour l'immunocytochimie.

Je remercie beaucoup Mr. Mark Shalinsky (Young Mark) and Mr. Newton Agrawal for their goOO deeds and computer wiz skills. Both provided me with their hilarious comments and more seriously great computer help allowing me to type my thesis and create the pietures for my seminars. 1also thank the tirst computer wiz, Dr. Ivan Shaw, for the sa many friendly conversations we had, and for trying sa patiently to improve my knowledge of computers.

Je remercie l'infatiguable équipe des secrétaires du département. Ms. Toula Papadopoulos et Ms. Linda Michel pour leur générosité et leur dynamisme.

•

,-,

•

1 am undebt to Mr. Marcus Arts and his team from the Neurophotography Department who processed patiently ail our pictures and were particularly helpful for the rapid printing of the photographs included in this thesis.

Je dédicace une mention toute spéciale aux Dr. Zvi Cohen and à Mr. Ahmed Elhusseiny, le duo des artistes dont j'ai pu admirer (with awe!) les danses et surtout les chants pendant les années PCR.

Many thanks to Dr. Dengshun Miao for developping the method 1 used for the colocalisation study and generously lending his material to carry it out. 1thank Dr. Durham and Dr. Karpati for giving and lending me very useful materials. 1thank Dr. Chun Wu from PharMingen, CA, who developped the S-HT28 receptor antibody and managed ta provide me with a sample of the protein to further charaeterize its specificity. He also introduced me to Dr. H.Y. Wang who was most helpful for the third part of my thesis by developping and carrying out a newenriched Western blot method. 1thank the Pathology Department of the Royal Vietoria hospital who rendered this studies possible by providing us with human tissues and helped a lot for their sectionning and conservation.

Finally these words are little to aknowledge ail the people 1had the opportunity to 1

know during my thesis and to tell them how much 1appreciated their friendship, good ideas and humour.

•

.., ..

_J

• CHAPITRE 1

INTRODUCTION GENERALE

•

1.1

Par son double aspect, la migraine a aussi bien inspiré les

•

visonnaires que les médecins et ceci, depuis la plus haute antiquité. En effet. elle se distingue à la fois par des symptômes neurologiques spectaculaires et une douleur intense. Ces deux caractéristiques ont respectivement orienté les recherches physiopathologiques vers des hypothèses de troubles nerveux ou vasculaires. Après des siècles de recherches sur ses

~;auses,

force est de constater que "When ail has been said that can be, mystery still envelops the mechanism of migraine" (W. Gowers, 1983, "Quand tout ce qui pouvait être dit a été dit, le mystère encore entoure la migraine"). En fin de XXème siècle, le débat n'est pas encore terminé.

Cependant, le développement d'outils pharmacologiques et de la biologie moléculaire fournissent maintenant des moyens aussi puissants que nouveaux pour étudier les mécanismes de la migraine. C'est sur l'utilisation de ceux-ci que cette thèse

s'appuie

pour éclaircir la

controverse

qui

règne

encore

sur

la

physiophathologie de la migraine, et ce, en vue d'améliorer sa prévention et le traitement de ses symptômes.

La migraine

Diagnostique La migraine se présente comme un désordre neurologique épisodique qui n'est pas associé à des lésions pathologiques détectables. Elle a souvent été confondue avec d'autres maux de tête comme la céphalée de tension. Ce n'est que la définition récente d'un certains nombre de critères diagnostiques précis par l' 'International Headache Society" (1988: voir table page suivante) qui a permis l'identification et la quantification des migraines.

•

Image Cl-dlIUus: "Headache ï PlIf H. TctI6er.:: NCIIIattIS.

1.1

•

CRITERES DIAGNOSTIQUES Migraine sans aura (migraine commune) A-

Au moins 5 attaques correspondant à 8 ...0.

B...

Céphalée durant de 4 à 72 heures (traitée avec succès ou non).

C-

Céphalée ayant au moins deux des caractéristiques suivantes 1-

Unilatéralité

2...

PulsatUité

3-

1ntensité moderée ou sévère

4-

Aggravation pendant la montée des eecaliers ou tout autre exercice routinier similaire.

0-

Au cours de la céphalée, au moins un des phénomènes suivants 1-

Nausée et/ou vomissements

2...

Photophobie et phonophobie.

Migraine avec aura (migraine classique) A-

Au moins deux attaques correspondant à B.

B-

Au moins 3 des 4 caractéristiques suivantes 1-

Un ou plusieurs symptômes d'aura complètement réversibles indiquant un mauvais fonctionnement localisé du cortex ou du tronc cérébral.

2-

Au moins un symptôme d'aura se développant graduellement pendant 4 mn, ou deux ou plusieurs symptômes se produisant successivement.

•

3-

Pas de symptômes d'aura d'une durée de plus de 60 mn

4-

La céphalée suit l'aura dans un intervalle de moins de 60 mn.

Modifié d'après les critères établis par le Comité pour la Classification des Céphalées, (Headache Classification Committee of the International Headache Society, Olesen et al., 1988). 1.3

•

Comme les manifestations de la migraine sont très variables d'un sujet à l'autre, nous allons décrire ses caractéristiques les plus communes.

Epidémiologie L'épidémiotogie de la migraine a été récemment revue (Rasmunssen, 1999) et sera brièvement rappelée ici. La migraine affecte environ 120/0 de la population dans le monde industrialisé. Sa prévalence varie peu selon les zones géographiques mais est clairement affectée par des facteurs comme l'âge et le sexe. En effet. elle touche environ trois fois plus de femmes (15-18% des cas) que d'hommes (s% des cas). Son incidence est très élevée durant les deuxième et la troisième décades de la vie et décroit fortement avec l'âge. Sa fréquence est donc particulièrement élevée dans la population active où elle est associée à un fort coût économique en termes de manque d'efficacité au travail et de congés de maladie (Stewart et al., 1997). Cependant, sa sévérité est très variable suivant les individus, allant d'une incapacité de l'ordre de quelques jours par an à une manifestation quasi quotidienne. Sa fréquence moyenne est de 2 à 4 attaques par mois.

Description Les caractéristiques les plus évidentes de la migraine (pour revue voir Ferrari, 1998; Lance, 1993) sont des céphalées intenses et. dans environ 30%

des cas, les

anomalies sensorielles qui la précèdent. L'occurence de ces dernières distingue la migraine classique (MA) ou "avec aura" sensorielle de la migraine commune (MO) qui en est dépourvue.

Avant ces manifestations ouvertes, un prodrome précède la migraine d'environ 24 heures. Il se manifeste surtout par des changements d'humeur, de l'irritabilité, des symptômes d'anxiété ou de dépression. On peût aussi noter de la somnolence et

•

des changements de l'appétit et de la soif. lA

•

L aura consiste en de multiples altérations de la perception sensorielle affectant surtout le système visuel. Les plus communément décrites par les patients incluent des lumières dans leur champ visuel (photopsie), des motifs géométriques en forme de fortification (téichopsie) ou au contraire des zones vides localisées (scotomes) pouvant s'étendre jusqu'à un aveuglement presque complet. 0' autres paresthésies peuvent se manifester, plus rarement cependant, comme par exemple une hypersensibilité au toucher du visage ou une sensation d'engourdissement affectant la nuque et parfois les bras. En général, l'aura est suivie du mal de tête mais dans de rares cas, elle se produit seule.

En général, la céphalée commence par une douleur sourde relativement localisée qui s'étend progressivement tout en devenant plus intense et lancinante avant de se stabiliser. Dans la plupart des cas (SO%), cette douleur n'envahit qu'un côté de la tête ce qui est l'origine du mot migraine (hémi crâne). Chez un même patient, le côté affecté est souvent le même. Il peut cependant changer d'une attaque à l'autre mais pas au cours d'une même attaque. La qualité de la douleur varie beaucoup, de sourde à aigue suivant les patients et les crises.

Les migraineux présentent souvent une forte photophobie ou une phonophobie qui les entiaine(nt) à arrêter leurs activités habituelles et à s'isoler dans l'obscurité. Ils ressentent aussi parfois des vertiges ou une difficulté à articuler leurs pensées. Des symptômes systémiques se manifestent aussi chez la plupart des patients. Ils incluent de l'anorexie, des nausées, de la rétention des fluides ou de la diarrhée.

Facteurs déclenchants ou de susceptibilité De multiples facteurs aussi bien d'origine externe que physiologique semblent pouvoir déclencher la migraine (pour revue, Scharff et al.. 1995). fis varient beaucoup selon les patients et une des premières ..thérapies" de la migraine consiste

•

à les identifier et les éliminer (Olesen, 1992). 1.5

•

Parmi les premiers. on peut citer l'ingestion de certains aliments comme le chocolat ou des boissons alcoolisées. l'administration de médicaments comme des antidépresseurs ou des situations de forte stimulation visuelle ou auditive. Le séjour en haute altitude et les changements barométriques et atmosphériques y jouent également un rôle.

Parmi les seconds. le stress émotionnel joue un rôle prépondérant mais aussi l'effort physique. les changements hormonaux ainsi que les variations de la glycémie ou de la durée du sommeil.

RESUME DES PRINCIPAUX FACTEURS DECLENCHANTS (Modifié d'après Qlesen. 1992) PSYCHOLOGIQUES

Stress Emotions fortes

ENDOGENES

Changements hormonaux Jeûne

EXOGENES

Fatigue Manque ou excès de sommeil Aliments Boissons Préparations hormonales Tabac Allergènes Nitrates Glutamate de sodium Forte lumière Changements météorologiques Altitude

•

1.6

Il existe en outre une forte co-morbidité entre certaines maladies et la migraine sans

•

que l'on sache toutefois precisément si le lien est causal (pour revue voir Gardner, 1999). Il en est ainsi de l'épilepsie et de la susceptibilité aux attaques d'apoplexie,

Jes troubles de l'humeur, de l'angine de PrinzmetaJ et du lupus érythémateux.

Plus de 70% des migraineux témoignent d'une histoire familiale de ce trouble. Des études de comparaison de jumeaux, on déduit la contribution de facteurs génétiques

à la migraine avec une héritabilité deux fois plus élevée dans la MA que la MO. Cependant, le mode de transmission n'est pas défini et semble relever de multiples gènes dont la pénétrance serait incomplète. Ceci ne fait que souligner l'importance de l'influence des nombreux facteurs environnementaux sur la manifestation de cette pathologie.

En conclusion, le syndrôme de la migraine rassemble des symptômes d'origines centrale et périphérique. Il semble se déclencher en réponse aux facteurs de stress de toute nature et témoigner d'une susceptibilité héréditaire à ces réactions.

Traitements

En accord avec ses manifestations protéiformes, les médicaments efficaces contre la migraine appartiennent à des catégories très variées et affectent des cibles très différentes (pour revue, Olesen 1992).

Traitements symptomatiques

Pour le traitement symptomatique, on peut citer tout d'abord les analgésiques comme l'acide acétyl salicylique (ASA), l'acétaminophène et les anti-inflammatoires non stéroïdiens (NSAID) qui sont des traitement relativement légers et très utilisés. Deux heures après administration. le taux de succès de tels traitements est de •

l'ordre de 440/0. Il est à noter qu'ils réprésentent un certain risque de dépendance 1.7

s'ils sont utilisés fréquemment. De plus, les NSAIO peuvent provoquer des

•

hémorragies gastrointestinales à cause de leurs propriétés inhibitrices de la synthèse des prostaglandines.

Des traitements plus puissants existent depuis longtemps à commencer par les dérivés d'ergots comme l'ergotamine tartrate. Il s'agit d'un médicament très efficace

à interrompre la céphalée mais produisant de nombreux effets secondaires qui l'ont fait remplacer par son dérivé, la dihydroergotamine (OHE). Ces deux composés ont une absorption très variable qui influe notablement sur leur efficacité. Néammoins, la céphalée d'environ 70% des patients est soulagée au moins en partie, 2 heures après administration (Callaham &Raskin. 1986). En outre. l'effet de ces composés dure plus longtemps que ne le laissait prévoir leur demi-vie sans doute grâce à la production de métabolites cliniquement actifs. Leurs effets secondaires les plus notables sont l'amplification de nntensité des nausées des migraineux, une conséquence qui encourage l'usage concomitant d'un antiémétique comme par exemple le métoclopramide. Les dérivés d'ergots peuvent aussi provoquer une dangereuse vasoconstriction en particulier dans les vaisseaux du coeur. Il est clair que le spectre de leurs effets est très vaste et cela reflète leurs multiples cibles moléculaires. Ces composés sont en effet des agonistes de nombreux récepteurs

à plusieurs neurotransmetteurs (e.g. adrénaline, dopamine: Silberstein. 1997)dont. en particulier. les récepteurs S-HT1 de la sérotonine qui sont tenus pour responsables de leurs effets vasculaires.

Un autre agoniste des récepteurs S-HT1. le sumatriptan. est récemment apparu comme le médicament le plus efficace contre la céphalée migraineuse (Doenicke et al.. 1988; pour revue Moskowitz et Cutrer. 1992). Son efficacité globale à deux

heures est d'environ 80%. De plus. ses effets secondaires sont beaucoup moins nombreux. Contrairement aux ergots et à leurs dérivés. il réduit les symptômes de nausée qui accompagnent la céphalée. Néammoins. comme eux, il provoque une •

contraction vasculaire qui a été associée à des accidents cardiaques et interdit son

L8

usage chez les sujets à risque (Kelly, 1995; pour revue, voir MaassenVanDenBrink

•

et al., 1998) .

Enfin, un certain nombre d'autres traitements symptomatiques se sont avérés relativement efficaces comme les stéroïdes,

certains neuroleptiques,

des

narcotiques, des antidépresseurs et des antagonistes des récepteurs opioïdes.

En prophylaxie, le choix des traitements est encore plus vaste que pour les thérapies symptomatiques (pour revue, Becker, 1999).

Traitements prophylactiques

Ces médicaments requièrent tous un traitement chronique, allant de quelques semaines à plusieurs mois, pour devenirefficaces. En général, leur utilisation permet un dosage plus faible que les traitements aigus et par conséquent, leurs effets secondaires sont plus modérés. Ils sont indiqués pour les patients dont les migraines sont fréquentes ou ne répondent pas aux autres traitements.

Levalproate, un médicament premièrement utilisé pour traiter l'épilepsie s'avère très efficace (réduisant de plus de 50 0/0 le nombre de jours de migraine) mais ceci après un long délai (environ 12 semaines). Malheureusement. il est aussi associé a des effets secondaires qui peuvent être importants comme des atteintes hépatiques. Ceci reflète sans doute son mode d'action très global. inhibant et stabilisant l'activité neuronale via l'augmentation de la neurotransmission de l'acide gamma amino butyrique (GABA).

Des composés antidépresseurs comme la zimélidine, se sont avérés dotés d'une certaine efficacité à long terme après néammoins avoir exacerbé les symptômes lors

•

des premières semaines de traitement (Syyahlati et al., 1979).

1.9

Les benzodiazépines sont parfois utilisées mais peu recommandées au vu de leurs

•

propriétés sédatives et de la dépendence qu'elle peuvent provoquer.

On peut encore citer les bloqueurs des canaux calciques comme le vérapamil ou la flunarizine qui pourraient affecter à la fois la vasculature et le système nerveux central.

Les antagonistes des récepteurs 5-HT2 de la sérotonine se sont avérés des traitements des plus efficaces (Mylecharane et al.. 1991). Parmi eux, le plus utilisé a longtemps été le méthysergide qui est assez puissant mais relativement non sélectif ce qui peut entraîner des effets secondaires comme la fibrose rétropéritonéale. Le pizotifène est un composé efficace et un antagoniste plus sélectif. Néammoins. il a été associé à une certaine sédation. Les antagonistes beta adrénergiques comme le propanolol. également très utilisé en prophylaxie, partagent aussi. dans une moindre mesure. cette propriété d'antagonisme des récepteurs 5HT2 (Kalkman, 1994).

Pour conclure cet bref exposé des médicaments les plus utilisés. on peut souligner que le nombre des traitements correspond à la variabilité de la qualité et de la fréquence des symptômes d'un patient à rautre. C'est donc par l'examen au cas par cas des patients qu'est fait le choix des composés les plus adaptés et de la dose la plus appropriée. Plusieurs traitements peuvent être utilisés successivement jusqu'à ce que soit identifié celui auquel le patient répondra le mieux et dont les effets secondaires affecteront le moins le mode de vie. Les facteurs de stress psychologique étant aussi fortement impliqués dans le déclenchement de la migraine. il est parfois utile que des thérapies comme la relaxation soient utilisées seules ou en accompagnement des prescriptions médicamenteuses. Néammoins, il est clair que les thérapies les plus efficaces proviennent du domaine de la

•

pharmacologie aussi bien pour les traitements symptomatiques que prophylactiques.

1.10

Physiopathologie

•

Un des phénomenes les plus marquants associés à la pathologie migraineuse est un ensemble de perturbations du système sérotoninergique qui sont mises en évidence par les variations de nombreux marqueurs. Celles-ci ont fait l'objet de revues comme par exemple par Humphrey (1991a) et seront résumées ici. Les premières observations font état d'une forte augmentation de l'excrétion de l'acide 5-hydroxyindole acétique, le principal métabolite issu de la dégradation de la 5-HT au cours de la céphalée migraineuse (Sicuteri et al., 1961; Curran et al., 1965; Fozard et al., 1982). Des quantités variables ont été mesurées par la suite (Curzon et al., '966; Ferrari et al., 1989). Il a finalement été suggéré que cet indice est peu

fiable à cause des perturbations de l'activité gastrointestinale présentes chez les migraineux (Fozard, 1982).

Un indice plus consistant est l'augmentation du niveau de 5-HT circulante au début la migraine (Ferrari et al., 1989). En effet. une libération plaquettaire de S-HT se produit au début de la céphalée dans la migraine sans aura (Ferrari et al., 1989). Elle est associée à une baisse de 15 a 50% du contenu en S-HT des plaquettes sanguines (Curran et al.. 1965; Anthony et al.. 1967; Fozard, 1982). Dans le cas de la migraine avec aura, un tel phénomène n'a pas été observé mais les corps denses plaquettaires qui contiennent la S-HT y sont plus développés que chez les témoins.

Il a été suggéré qu'il existe un facteur plasmatique responsable de la libération de la S-HT pendant la migraine et absent du sang pendant la période interictale (Dvilanski et al., 1976). Ceci a cependant été infirmé par d'autres auteurs pour des raisons méthodologiques (Ferrari et al., 1989).

Ils semble donc que plusieurs importants paramètres de fa transmission sérotoninergique sont affectés au cours de la migraine. On peut cependant se •

demander s'ils ne témoignent pas d'une réaction à un stress généralisé plutôt que 1. 11

de la migraine elle-même. La

•

ré~onse

à cette question pourrait veroir d'un examen

plus approfondi des effets des agents sérotoninergiques et de leurs mécanismes.

De fait, de nombreux agents modulant les niveaux de S-HT ont des effets marqués sur le déroulement des crises de migraine. L'administration de réserpine. qui vide les réserves corporelles de monamines. induit des migraines chez la plupart des migraineux. Au contraire. dans les mêmes conditions, les sUjets en bonne santé ne ressentent qU'un faible mal de tête (Kimball et al., 1960; Anthony et al., 1967; Caroll et a/.. 1974). De même. l'administration de fenfluramine, qui entraîne uniquement la

libération de 5-HT, induit eUe aussi des migraines chez les migraineux (dei Bene et al. 1977).

Dans la même perspective. l'administration d'antidépresseurs inhibant la recapture de S-HT et augmentant sa concentration synaptique. comme la zimelidine (Syvahlati et al., 1979; Sommerville et al.. 1982), le citalopram (Bouchard et al., 1987). la

fluvoxamine (Curran et al., 1986) et la fluoxétine (Remick et al., 1989) entraînent ou aggravent les céphalées. En fait. il semble qu'au cours des traitements antidépresseurs une aggravation soit notée les premières semaines. suivie à long terme d'une certaine amélioration de la condition migraineuse (Genefke et al., 1975; Syvahlati et al.. 1979).

Par ailleurs, l'injection intramusculaire de S-HT est capable de soulager des attaques de migraine spontanées (KimbaU et al., 1960; Anthony et al ., '967) ou induites par la réserpine (Anthony

et al., 1967).

Il semble donc que la S-HT puisse exercer des effets opposés suivant son site d'action central ou périphérique. Ceux-ci pourraient être médiés par ses nombreux récepteurs, distribués différemment dans les tissus cérébraux et vasculaires.

•

Les études pharmacologiques et cliniques viennent appuyer ce point de vue. En 1.12

•

effet, depuis la première étude de Sicuteri (1961) montrant que l'antagoniste sérotoninergique méthysergide est efficace dans la prévention de la migraine, de nombreux autres composés ont été impliqués soit dans le traitement symptomatique de la migraine soit dans sa prophylaxie.

Les agonistes des récepteurs 5-HT1 représentent le traitement de choix de la crise de céphalée migraineuse et sont inefficaces en prophylaxie. Les premiers composés de ce type ont été l'ergotamine ainsi que la dihydroxyergotamine (DHE). Ces deux composés sont des agonistes des récepteurs 5-HT1 mais aussi de nombreux autres récepteurs y compris des récepteurs non sérotoninergiques comme des récepteurs a-adrénergiques ou dopaminergiques (Silberstein, 1997; Connor et al., 1992) ce qui entraîne un large spectre d'effets secondaires indésirables.

Plus récemment, un rnédicament plus efficace a été synthétisé, le sumatriptan, qui est un agoniste sélectif des récepteurs S-HT1 (Peroutka et McCarthy, 1989; Humphrey et Feniuk, 1991 pour revue). Son efficacité thérapeutique est élevée mais, bien qu'il présente moins d'effets secondaires que les dérivés d'ergot. son utilisation est limitée par les risques cardiaques qu'if fait encourir aux patients susceptibles (MaassenVanDenBrink et al.. 1998).

De nombreux composés non sélectifs et issus de différentes catégories pharmacologiques sont utilisés en prophylaxie mais il semble que les plus efficaces d'entre eux comme le méthysergide. le pizotifène et ie propranolol (pour revue Olesen. 1992), n'ont en commun que des propriétés antagonistes des récepteurs de type 5-HT2 (pA2. 6.1-6.5; Kalkman. i994). Dans le cas du propréinolol. bien qu'ii ait une plus forte affinité pour les récepteurs 5-HT1A (Ki 29 nM. Newman-Tancredi et al., 1997), cette propriété ne semble pas responsable de ses effets prophylactiques

•

puisque les agonistes sélectifs des récepteurs 5-HT1A ne sont pas des

l.1]

•

antimigraineux efficaces. Il est aussi possible que l'on clarifie l'implication d'autres récepteurs plus récemment clonés comme le récepteur S-HT7. Il existe en effet maintenant plus de 14 différents récepteurs de la S-HT qui sont regroupés en 7 familles selon leurs propriétés distinctes structurales. pharmacologiques et fonctionnelles.

Le paragraphe suivant exposera donc les informations disponibles au début de cette étude et concernant les récepteurs de la S-HT, il est à noter que leur nomenclature a été récemment révisée (Hoyer et al., 1994; Hoyer et Martin, 1997). Dans cette thèse, après l'exposé des propriétés des récepteurs, ceux-ci seront nommés conformément à la nomenclature actuelle.

•

1.14

•

Les récepteurs de la 5-HT

Il Y a aujourd'hui au moins 14 récepteurs de la sérotonine qui ont été identifiés. la plupart l'ont été au cours des dernières années grâce au progrès des méthodes de clonage. Cela a entraîné une reclassification des récepteurs tenant compte non seulement de leur caractéristiques pharmacologiques mais aussi de leur structure moléculaire et de leurs systèmes de transduction. De nouveaux regroupements de récepteurs ont ainsi été formés et leur nomenclature changée (voir Hoyer et al.. 1994; Hoyer et Martin, 1997; voir tableau page suivante). C'est ainsi que les récepteurs S-HT1 Da et S-HT1 DJ3 chez l'humain sont devenus les récepteurs 5-HT1 B et S-HT1 D, le récepteur 5-HT1 C est devenu le récepteur 5-HT2C, et le récepteur 5HT2, le récepteur 5-HT2A. Ces changements sont récapitulés dans le tableau présenté page suivante. Dans le cadre de l'exposé ci-dessous, il sera fait référence prioritairement aux travaux réalisés chez l'homme et qui sont, à ce titre, plus significatifs pour l'étude de la migraine.

les récepteurs de la 5-HT sont maintenant regroupés en 7 catégories principales: les récepteurs 5-HT1, S-HT2, 5-HT3, 5-HT4, 5-ht5, 5-ht6 et 5-HTI. Tous (sauf les récepteurs 5-HT3 qui sont des canaux cationiques) sont des protéines formées de 7 domaines transmembranaires présentant une forte homologie et sont associés à des protéines G pour leur transduction intracellulaire.

•

1.15

•

NOMENCLATURE DES RECEPTEURS

RECEPTEUR

SOUS-TYPE

5-HT1

S-HT1A

NOM INITIAL

5-HT1B

5-HT1Dl3

5·HT1D

5..HT1Da

TRANSDUCTION

5-HT1E

5-HT2

5-HT1F

5-HT1EP

5..HT2A

5-HT2

5-HT28

5-HT2F

5-HT2C

5-HT1C

5-HT3

canal cationique

5·HT4

"'AMPc

5-ht5

S-ht5A

nd

5 -ht5B

•

5-ht6

"'AMPc

S-HT7

"'AMPc

1.16

•

Les récepteurs 5-HT1 se distinguent par leur haute affinité pour le ligand endogène. Leur groupe est composé des récepteurs 5-HT1A, 5-HT1 B. S-HT1 D, S-HT1 F et 5HT1 E. Ils sont tous encodés par des gènes sans introns et pour leur signalisation intracellulaire, associés à l'inhibition de l'adénylyl cyclase stimulée par la forskoline (pour revue, Hoyer et al., 1994).

Le récepteur 5·HT1 A

Ce récepteur a été tout d'abord identifié pharmacologiquement (Pedigo et al.. 1981) et rapidement caractérisé en particulier grâce un agoniste sélectif, le 8-QH-O-PAT (Gozlan et al., 1983: pour revue Hoyer et al., 1994). Néammoins, ce n'est que récemment que des antagonistes sélectifs comme le WAy 100 635 ont pu être synthétisés (Fletcher et al., 1996).

Le clone du récepteur a été identifié chez l'humain (Fargin et al., 1988) et la distribution de ses ARNm (Bumet et al., 1995) correspond bien à la localisation de ses sites de liaison (Pazos et al., 1985; Kung et al., 1995). Il est abondant dans l'hippocampe. le septum, le cortex enthorinal et cingulaire ainsi que les noyaux du Raphé. Ces localisations ainsi que des études de lésions indiquent que le récepteur est présynaptique et postsynaptique (Radja et al., 1992). Il est en particulier présent comme autorécepteur sur les neurones à 5-HT issus du Raphé dont if inhibe la décharge neuronale (Aghajanian et al., 1972 ; pour revue Aghajanian et al., 1995). Il a aussi été détecté dans des neurones sensoriels en périphérie (Todorovic et Anderson, 1992) où il pourrait jouer un rôle dans le phénomène d'hyperalgésie (Fasmer et al., 1986). En lien avec sa localisation dans le sytème limbique et sur les neurones à 5-HT, ce récepteur pourrait aussi jouer un rôle dans la régulation de l'humeur. En effet, de nombreux antidépresseurs comme le buspirone ou le gépirone

•

sont des agonistes des récepteurs 5-HT1A (Traber et Glaser, 1987: Robinson et al.,

1.17

•

1990).

Les récepteurs S-HT1 8/1 0

Ces récepteurs ont tout d'abord été reconnus comme les sites ayant une haute affinité pour la S-HT et une basse affinité pour le spipérone (Pedigo et al., 1981). Les deux récepteurs présentent un profil pharmacologique très similaire, plus de 30 ligands ayant une affinité semblable pour ces 2 sous-types (Hartig et al.. 1992 ; voir Hayer et al., 1994 pour revue). Ils ont en commun un grand nombre d'agonistes, en particulier le sumatriptan (Pilgrim, 1994; Pascual et al., 1996), un antimigraineux efficace. Il existe aussi da tons ~:1tagonistessélectifs comme le GR 127 935 et ses dérivés (Skingle et al., 1995), capables de les distinguer des autres récepteurs 5HT1. En outre, certains composés moins sélectifs comme la kétansérine et la ritansérine (des antagonistes des récepteurs 5-HT2) ont une affinité 15 à 30 fois plus élevée pour les sites 5-HT1D que pour les sites S-HT1 B (Kaumann et al., 1994; Pauwels et al., 1996).

Chez l'humain, les séquences des deux récepteurs sont particulièrement proches (77%

d'homologie de leur composition en acides aminés dans les régions

transmembranaires. Hartig et al., 1992 pour revue). Chez l'humain, ils ont d'abord été appelés 5-HT1Da et S-HT1DI3 en raison de leur très grande proximité pharmacologique (Weinshank et al., 1992). Le récepteur 5-HT1DI3 humain est pharmacologiquement moins proche du récepteur 5-HT1 B du rat en ce qui concerne son affinité pour les antagonistes

~

adrénergiques, plus basse chez l'humain.

Néammoins, leur clonage a démontré qu'ils sont homologues et entraîné la reclassification des récepteurs S-HT1 Da et 5-HT1 DI3 en récepteurs 5-HT1D et 5HT1 B suivant des critères moléculaires (Hartig et al., 1996).

•

1.18

•

les deux récepteurs ont une aussi une localisation similaire. le récepteur S-HT10 étant tOl'tefois moins abondant. Chez l'humain. ces récepteurs. détectés par radioautographie. (Bonaventure et al.. 1997) sont présents dans le noyau caudé. le putamen. la substance noire. le globus pallidus. ainsi que dans le nucleus accumbens et l'hippocampe.

Le récepteur S-HT1 B

Son rôle comme autorécepteur localisé sur les terminaisons nerveuses est bien établi (pour revue. Hoyer et al.. 1994). En effet, l'expression de son ARNm est réduite par la lésion des noyaux du Raphé chez le rat (Doucet et al., 1995). Chez l'homme. il existe des différences entre la distribution des ARNm et celle des sites de liaison indiquant une localisation présynaptique sur les terminaisons nerveuses (Jin

et al.. 1992: Bruinvels 1994a. 1994b). la pharmacologie confirme ces

observations. indiquant que le profil de l'autorécepteur régulant la libération de la 5HT chez l'homme correspond à celui du récepteur 5-HT1 B plutot que du récepteur S-HT 10 (Galzin

et al.. 1992: Maura et al., 1993; Fink et al.. 1995; Schlicker et al..

1997: pour revue voir Middlemiss et Hutson 1990). C'est aussi un hétérorécepteur associé à l'inhibition de la libération in vitro d'acétylcholine (Cassel et al., 1995) dans l'hippocampe et de dopamine dans le cortex frontal (lyer and Bradberry, 1996) chez le rat. Il a aussi été impliqué dans l'inhibition de la libération de glutamate (Maura et

al., 1998) et de GABA dans le cortex humain (Feuerstein et al., 1996)

Le récepteur S-HT1D

Sa similarité pharmacologique avec le récepteur S-HT1B et son bas niveau d'expression ont rendu l'étude de sa localisation plus difficile. Sa distribution a

•

néammoins été établie par radioautographie (Castro et al., 1997) et hybridation in 1.19

•

situ (Bruinvels et al., 1994a; 1994b) et suit celle du récepteur S-HT1B. Des études

pharmacologiques suggèrent sa présence dans les noyaux du Raphé contenant les neurones à S-HT où pourrait il réguler la libération de S-HT (Pirieyro et al., 1995; 1996).

Plusieurs indices laissent

penser que les récepteurs S-HT1 B et/ou S-HT1D

pourraient jouer un rôle important dans la céphalée migralneuse.Tout d'abord. le médicament antimigraineux sumatriptan est un agoniste sélectif de ces récepteurs (Schoeffter et

Hoyer.

1989;

Hoyer

et

al..

1994).

Ensuite,

les études

pharmacologiques et moléculaires suggèrent la présence de l'un et/ou de l'autre dans les vaisseaux intracrâniens (Deckert et al., 1994; Hamel et Bouchard 1991; Martin et al. 1991; Hamel et al., 1993a. 1993b) et dans le ganglion de Gasser (Buzzi et al., 1991 c; Bruinvels et al., 1992; Rebeck et al., 1994), deux tissus impliqués dans

la migraine (pour revue voir Moskowitz, 1992). En outre. un rôle de ces récepteurs a été démontré dans la contraction de l'artère coronaire (Bax et al., 1993), un effet secondaire possible des thérapies antimigraineuses. Cependant, les récepteurs impliqués et leurs rôles respectifs n'ont pas été complètement déterminés dans tous ces phénomènes.

Le récepteur S-HT1E

Le rôle de ce récepteur, pourtant cloné dès 1992 (McAllister et al.. 1992) chez l'humain, est encore mal connu car aucun ligand sélectif n'est encore disponible. Sa pharmacologie est proche de celle du récepteur S-HT1 F. Comme ce dernier, il a une haute affinité pour la S-HT et une basse affinité pour la S-CT . Mais. contrairement

à ce dernier. il est insensible au sumatriptan (McAllister et al.. 1992; Martin. 1994). La distribution de ses sites de liaison indique sa présence surtout dans le noyau

•

1.20

•

caudé. ainsi que dans une moindre mesure dans le cortex enthorinal, le putamen, le claustrum, l'hippocampe et l'amygdale chez l'humain (Miller et Teitler 199?). Son ARNm présente une distribution similaire dans le caudé et le putamen, le cortex, mais aussi dans l'hypothalamus (Bruinvels et al., 1994a, 1994b).

Le récepteur S-HT1 F

C'est sa forte homologie avec les récepteurs S-HT1 B et S-HT1 0 qui a permis son clonage (Adham et al.. 1993) mais, à cause de sa pharmacologie proche de celle du récepteur S-HT1 E cloné juste avant lui, il a d'abord été identifié comme récepteur 5HT1 E~. Les études radioautographiques l'ont distingué grâce à sa forte affinité pour la 5-HT et le sumatriptan et sa basse affinité pour la S-CT. Au cours de cette thèse, des ligands sélectifs comme le LY 344864 (Phebus et al., 1997) et le LV 334370 (Johnson et al., 1997) ont été développés, ils se sont avérés des agonistes puissants et des antimigraineux potentiels. Les sites de liaisons des radioligands sont situés dans le cortex et l'hippocampe, le claustrum et le noyau caudé ainsi que les ganglions de la base. Dans l'ensemble. le récepteur est peu abondant. Un rôle possible comme autorécepteur a été suggéré (Waeber et Moskowitz. 1995b) et son ARNm a été détecté dans le noyau du Raphé dorsal chez le rat (Bruinvels et al., 1994a). Le sumatriptan a une forte affinité pour le récepteur S-HT1 F (pKi 7.6, Adham et al., 1993) suggérant que ce récepteur pourrait médier certains effets antimigraineux.

•

1.21

•

Les récepteurs S-HT2

Cette catégorie, récemment remaniée, est composée des récepteurs 5-HT2A, 5HT28 et 5-HT2C (anciennement S-HT1 C) qui ont une forte homologie entre eux mais sont bien distincts des autres familles de récepteurs de la 5-HT (Baxter et al., 1995). Tous les trois sont couplés à la stimulation de la phospholipase C (PLe). entrainant une accumulation des phosphates inositols et du calcium intracellulaire (pour revue voir Sanders-Bush et Canton, 1995). Ils présentent de nombreuses similarités du point de vue de leur structure moléculaire. En particulier, contrairement aux récepteurs S-HT1, leurs séquences codantes sont interrompues par des introns.

Il existe de nombreux antagonistes de ces récepteurs mais des agonistes sélectifs sont encore peu nombreux. Parmi ces derniers, on utilise souvent les agonistes mCpp et 001 bien que ceux-ci soient seulement des agon;stes partiels. Pour les distinguer entre eux, la ritansérine et le spipérone sont utiles car ils présentent une plus forte affinité pour les récepteurs S-HT2A que les récepteurs S-HT2B/2C. De plus, durant le courant de cette thèse, des antagonistes plus sélectifs pour les différents membres de cette famille ont été développés (pour revue voir Baxter et al., 1995; Bonhaus et al., 1997).

Les antagonistes de ces récepteurs se sont montrés efficaces dans certaines pathologies par exemple l'anxiété. les troubles du sommeil (Baxter et al.. 1995) et la migraine (Fozard et Kalkman. 1994). Il est aussi à noter que des antipsychotiques (e.g. la clozapine) et antidépresseurs (eg les tricycliques) ont une assez haute affinité pour les récepteurs 5-HT2A et 5-HT2C (Canton et al.. 1990: Jenck et al., 1993).

•

1.22

•

Les récepteurs 5·HT2A

Ils sont caractérisés par leur basse affinité pour la S-HT (micromolaire) et leur haute affinité pour un grand nombre d'antagonistes comme la ritansérine . la kétanserine et le spipérone ainsi que l'agoniste 001. Cloné chez l'humain. (Saltzman et al., 1991) le gène presente 2 introns. Les études radioautographiques indiquent sa présence dans le cortex, le noyau caudé, le noyau accumbens, les tubercules olfactifs et l'hippocampe (Pazos et al., 1987), une distribution qui concorde bien avec celle des ARNm (Burnet et al., 1995) et suggère une localisation postsynaptique de ce récepteur.

La régulation des récepteurs 5-HT2A présente une caractéristique inhabituelle puisque leur nombre décroit aussi bien avec l'exposition chronique à des antagonistes qu'à des agonistes (e.g. Sanders-Bush, 1990).

D'un point de vue électrophysiologique, ils apparaissent comme des récepteurs excitateurs dans le cerveau (Aghajanian, 1995). Par ailleurs, le récepteur 5-HT2A médie une contraction du muscle lisse de nombreux vaisseaux périphériques (pour revue. Hoyer et al., 1994) comme l'artère coronaire humaine (Bax et al.. 1993).

Le récepteur 5·HT28

Ce récepteur a d'abord été identifié comme médiant la contraction musculaire du fundus de l'estomac chez le rat (Vane et al.. 1959) et à ce titre d'abord appelé 5HT2F avant d'être reclassifié (Humphrey et al., 1993). Ses caractéristiques pharmacologiques sont très proches de celles du récepteur S-HT2C (Buchheit et al., 1986) avec lequel il a été confondu pendant de longues années. Il présente

•

cependant une plus faible affinité pour fa ritansérine mais une plus forte affinité pour 1.23

•

la yohimbine que les autres sous-types de récepteurs S-HT2. Au cours de cette thèse, certains antagonistes et agonistes plus sélectifs ont cependant été développés (Bonhaus

et al., 1995).

Le récepteur, cloné chez l'humain présente 2 introns qui interrompent sa séquence codante (Schmuck et al., 1994) . Son niveau d'expression est réduit. Son ARNm est faiblement exprimé dans le cerveau chez l'homme (Kursar et al.. 1994: Bonhaus et al., 1995) et la souris (Loric et al., 1992). Chez le rat. il n'a d'abord pas pu être

détecté dans le cerveau (Kursar confirmée (Duxon

et al., 1992) mais sa présence y a été ensuite

et al., 1997).

Sa distribution est en fait limitée à certaines régions cérébrales comme en particulier le cervelet, le septum latéral, l'hypothalamus dorsal et l'amygdale. " a aussi été détecté dans la mœlle épinière chez l'humain (Helton et al., 1994).

Il est a noter que si comme les autres récepteurs 5-HT2, le récepteur S-HT28 a été associé à l'hydrolyse des inositols phosphates, il a aussi été montré que, de façon indépendante, il est aussi capable de provoquer une libération de calcium à partir des réserves intracellulaires dans les cellules endothéliales d'artère pulmonaire humaine (Ullmer et al., 1996) et dans le fundus de l'estomac de rat (Cox et Cohen, 1996).

Le récepteur S-HT2C

" a d'abord été appelé S-HT1 C à cause de sa forte affinité pour la S-HT en commun avec les récepteurs S-HT1 (pazos et al., 1984) mais reclassé dans la catégorie des récepteurs S-HT2 selon sa structure moléculaire et ses caractéristiques

•

transductionnelles (Humphrey et al., 1993) . 1.24

•

Sa pharmacologie est très proche de celle des autres récepteurs 5-HT2 (Hayer et al., 1994; Baxter et al., 1995) et il est sensible à des agonistas comme le m-CPP et

le 001. Mais, contrairement aux récepteurs 5-HT2A, il a une plus faible affinité pour le spipérone et la kétanserine. Des antagonistes sélectifs ont très récemment été développés, qui permettent de discriminer les récepteurs S-HT28 et 5-HT2C (Bonhaus et al., 1995; 1997) mais ils n'étaient pas disponibles au début de cette thèse.

Sa séquence (Saltzrnan et al., 1991) est interrompue par trois introns. Un variant tronqué de ce récepteur a aussi été identifié (Canton et al., 1996; Xie et al., 1998) dépourvu de site de liaison de la S-HT et non fonctionnel. Le récepteur peut par ailleurs, subir des modifications postranscriptionnelles résultant en de nombreux variants dont la distribution, les caractéristiques pharmacologiques et la régulation sont distinctes (Burns et al., 1997).

Le récepteur (Palacios et al., 1991: Abramovski et al., 1995) et son ARNm ( Mengod

et al.,1990) sont détectés dans le plexus choroïde, le cortex, l'hippocampe, l'amygdale, le noyau accumbens et les ganglions de la base. Sa fonction spécifique est mal connue car il a longtemps été confondu avec le récepteur S-HT2B. Néammoins, dans le plexus choroïde où il est abondant. il a été associé à la formation du liquide céphalorachidien (CSF, Kaufman et al., 1995). Il pourrait aussi être impliqué dans la régulation de l'appétit comme en témoignent les observations sur les souris dépourvues de récepteur 5-HT2C (Tecott et al, 1995).

Un rôle de ces deux récepteurs a été proposé dans la migraine. Les premières hypothèses impliquaient le récepteur 5-HT2C (Fozard et Gray, 1989; Fozard, 1992) mais, à la suite du clonage du récepteur 5-HT2B (Schmuck et al.. 1994), un rôle de

•

ce dernier est apparu au moins aussi probable {Fozard et Kalkman 1994; Kalkman, 1.15

•

1994; Schmuck et al., 1994). En effet, il existe une corrélation entre l'affinité de certains antagonistes aux récepteurs S-HT2B ou S-HT2C et leurs propriétés antimigraineuses (Fozard, 1990: Fozard et Kalkman, 1994; Kalkman 1994). Les mécanismes impliqués seraient déclenchés par l'action vasculaire des récepteurs 5HT2B et S-HT2C. En effet. ces récepteurs, identifiés pharmacologiquement. ont été décrits dans plusieurs lits vasculaires et associés à une dilatation dépendante de l'endothélium (pour revue Martin 1994; Hayer et Martin, 1997) qui pourrait être un des éléments déclenchants de la céphalée migraineuse.

Le récepteur S-HT3

C'est le seul des récepteurs de la 5-HT ctonés à être un canal ionique (Belleli et al., 1995) et c'est le seul récepteur des monamines associé à une transmission synaptique rapide dans le cerveau (Sugita et al., 1992). Il existe un bon nombre d'antagonistes sétectifs de ce récepteur comme l'ondansetron, le granisetron et le tropisetron.

Le récepteur est largement distribué, aussi bien dans le CNS que dans les tissus périphériques. Chez l'humain, il se trouve dans le complexe vaguai dorsal du tronc cérébral comprenant l'area postrema, le nucleus tractus solitarius et le noyau dorsal du nerf vague (pour revue voir Pratt et al., 1990a; 1990b) des régions impliquées dans le réflexe de nausée. On le détecte aussi dans le caudé, le putamen l'hippocampe, l'amygdale et le cortex cérébral mais son niveau d'expression y plus bas (Bames et al., 1989; Abi-Dargham et al.. 1993).

Les antagonistes de ces récepteurs sont dotés de propriétés thérapeutiques contre l'anxiété et les psychoses (Bentley et Bames, 1995) ainsi que de propriétés

•

antiémétiques (voir Hoyer et al. 1994). Un rôle dans la migraine avait été proposé 1.26

•

au vu de sa présence dans les terminaisons sensorielles du ganglion de Gasser comme il a été démontré chez l'humain (Waeber et al., 1997). Mais. jusqu'ici. les essais cliniques ont montré que des antagonistes les récepteurs S-HT3 sont dépourvus d'effets antimigraineux (Ferran et al., 1991).

Le récepteur 5-HT4

Ce récepteur récemment cloné chez l'humain (Van den Wyngaert et al.. 1997; pour revue Bockaert et al., 1998a) est associé à la stimulation de l'adénylate cyclase (pour revue Bockaert et al., 1998b). Il se trouve exprimé dans la substance noire. le caudé et le putamen. l'hippocampe et le cortex frontal (Domenech et al.. 1994). Son ARNm a aussi été détecté dans la dure-mère. l'arachnoïde, et l'artère méningeale moyenne (Schmuck et al.. 1996). Bien que sa pharmacologie soit proche de celle du récepteur S-HT3, il existe maintenant des antagonistes sélectifs de ce récepteur (voir Bockaert et al., 1998a).

D'un point de vue fonctionnel, il a été associé à la modulation de la libération de la dopamine (Benloucif et al., 1993) et de l'acétylcholine (Consolo et al.. 1994). ce dernier mecanisme pouvant expliquer son effet positif sur les performances cognitives (Terry et al.. 1998). Il a aussi été impliqué dans des effets pro- et antinociceptifs (pour revue Eglen.

1997a). Enfin, il exerce une fonction

vasodilatatrice dans certains vaisseaux comme par exemple la veine pulmonaire chez le mouton (Cocks et Arnold, 1992).

•

1.27

•

Les récepteu rs 5-ht5

Conformément au recommandations du comité pour la nomenclature de l'IUPHAR (Hayer et al, 1994) le nom de ces récepteurs est encore éCrit en lettres minuscules car aucun corrélat fonctionnel de leur activation n'a encore été démontré dans le tissu natif.

Ces récepteurs sont encore mal connus. Ils semblent couplés aux protéines G in vitro mais leur stimulation ne modifie pas le niveau de l'AMP cyclique ou des inositols

phosphates dans les systèmes d'expression in vitro (Erlander et al., 1993). Le gène cloné chez l'humain comprend un intron (Rees et al., 1994).

Son expression a été détectée dans le cerveau, le cervelet et la moëlle épinière (Rees et al., 1994),

r hippocampe,

l' hypothalamus et le noyau du Raphé dorsal

(Hoyer et al. 1994; Hoyer et Martin 1997).

Le récepteur 5..ht6

Cloné chez l'humain (Kohen et al., 1996), c'est un récepteur stimulateur de l'activité de l'adenylyl cycfase (Kohen et al., 1996). Il n'existe pas encore de ligand sélectif.

Il est principalement exprimé dans le CN5 et très peu en périphérie. Chez l'humain, on trouve son ARNm dans le noyau caudé, l' hypothalamus, le noyau du Raphé dorsal et le cervelet (Kohen et al., 1996) .

•

1.28

•

Les récepteurs S-HT7

Ce récepteur est associé à la stimulation de l'adénylyl cyclase (Bard et al., 1993; pour revue Eglen et al.. 1997b). If présente une forte affinité pour la S-HT et la S-CT. L'agoniste 8-0H-O-PAT du récepteur S-HT1A a une certaine affinité pour le récepteur S-HT7 (Plassat et al., 1993). 1/ en est de même de nombreux antidépresseurs (Roth et al., 1994).

Les récepteurs sont localisés dans l'hypothalamus, le thalamus et l'hippocampe et le ganglion trigeminalis caudalis (Eglen et al., 1997b) ainsi que les méninges, les artères meningéales (Schmuck et al., 1996) et le ganglion de Gasser (Terrén et al. , 2000; voir annexe 1de cette thèse).

Ces localisations et son association avec la dilatation du muscle lisse vasculaire in vivo et in vitro (pour revue Eglen et al., 1997b) ont suggéré qu'il pourrait jouer un rôle

dans la migraine (Terrén, 1998). Il semble aussi impliqué dans la régulation des rythmes circadiens (Eglen et al., 1997b).

•

1.29

Origines de la S-HT

•

La S-HT qui atteint les récepteurs qui pourraient jouer un rôle dans la migraine peut provenir de plusieurs sources. Dans le sang, au début de la crise. on remarque une libération de S-HT d'origine plaquettaire, mais celle-ci ne suffit pourtant pas à rendre entièrement compte de la forte augmentation de l'excrétion du métabolite de la 5-HT, le S-HIAA chez les migraineux (Fozard et al., 1982). Une partie de la S-HT qui est ainsi dégradée a donc fort probablement une origine neuronale. En effet. des fibres nerveuses contenant de la S-HT innnervent les vaisseaux extracérébraux et pénètrent leur paroi vasculaire. L'origine de ces fibres est encore sujet à controverse mais deux principales populations ont été mises en évidence: des fibres sérotoninergiques issues du noyau du Raphé (Edvinsson et al., 1983; Scatton et al., 1985; Bonvento et al., 1991; Lapez de Pablo et al.. 1996; Moreno et al., 1997) et des fibres sympathiques issues du ganglion cervical supérieur capables de libérer localement la S-HT (Chang et al., 1988; 1989; Cohen et al., 1992). Les proportions relatives de ces deux types de fibres innervant un vaisseau sanguin extracérébra 1 pourraient dépendre de son calibre. les vaisseaux de faible diamètre recevant préférentiellement une innervation centrale comme les vaisseaux sanguins intracérébraux et les vaisseaux plus larges recevant principalement la S-HT à partir des fibres sympathiques (Bonvento et al., 1990: 1991).

•

1.30

Le sumatriptan et son mode d'action

•

Des nombreuses observations concernant la 5-HT et la migraine, deux faits sont particulièrement marquants: la capacité de la S-HT à soulager rapidement la céphalée migraineuse après injection (Kimball et al., 1960) et sa capacité vasoconstrictrice des vaisseaux céphaliques (pour revue, Saxena et Ferrari, 1992). Ceci a entraîné le développement de dérivés de la S-HT pour le traitement symptomatique de la migraine. L'un d'entre eux, le sumatriptan (Humphrey et al., 1988; 1989: Humphrey et Feniuk, 1991 b). s'est avéré particulièrement efficace et

n'induit pas le spectre d'effets secondaires produits par l'administration de S-HT.

Le sumatriptan:

Les propriétés pharmacologiques et cliniques du sumatriptan ont fait l'objet de nombreuses revues (e.g. Peroutka 1990; Humphrey et Feniuk, 1991 b; Ferrari et Saxena, 1992; Moskowitz et Cutrer, 1992). Ce médicament est disponible en formules intraveineuse, sous cutanée, orale et en vaporisateur nasal. Sa demi-vie dans le plasma est d'environ 2 heures (Fowler et al., 1991). Il est rapidement absorbé et ne passe pas la barrière hémato-encéphalique en conditions normales (pour revue, Humphrey et Feniuk, 1991). Il doit être administré après le début de la crise de céphalée pour être efficace. Son effet thérapeutique (Pilgrim, 1994) est maximal entre 2 et 4 heures après administration. Une heure après le traitement, il y a une amélioration ou une disparition des symptômes chez environ 80% des patients (placebo 55%).

Cependant, le sumatriptan n'est pas efficace pour toutes les crises même chez des patients répondant en général positivement au traitement. Par ailleurs, dans environ 100/0 des cas. il ne produit jamais d'amélioration.

•

1.31

Un des principaux problèmes associés à ce traitement est le haut taux de récurrence des attaques (qui atteint 400/0 au cours des 24 heures) même après l'administration

•

de multiples doses pour tenter de compenser sa dégradation (The oral sumatriptan international multiple-dose study group (Ferrari et a/.), 1991). En fait, il ne s'agit peutêtre pas de récurrence à proprement parler car de nombreux patients dont le sumatriptan a d'abord soulagé fa céphalée gardent la sensation que leur crise continue néammoins. Cela voudrait dire que les symptômes de leur migraine ne sont que transitoirement masqués et ressurgissent quand l'effet du traitement s'estompe. Pou r autant que cette sensation puisse refléter des phénomènes physiologiques réels, elle signifierait que fe sumatriptan n'a pas d'effet sur les facteurs déclenchants de la migraine mais uniquement sur les symptômes de la crise. Ceci est en accord avec les observations cliniques montrant que l'administration du sumatriptan avant le début de la céphalée ne produit aucun effet thérapeutique. Cependant. malgré cet inconvenient, l'arrivée sur le marché de ce medicament a considérablement amélioré la qualité de vie des migraineux et diminue le fort coût économique de la migraine dans la population active.

Son utilisation est pourtant parfois contre-indiquée. En effet. le sumatriptan provoque des effets secondaires indésirables comme des sensations de malaise, d' étourdissement et de fatigue chez environ 9% des patients ainsi que des nausées et des vomissements chez 140/0 d'entre eux (Brown et al.. 1991). De plus, chez environ 5% des patients des sensations d'étouffement et des douleurs dans la poitrine ont été remarquées et ont soulevé des doutes quant à l'inocuité de ce traitement. Plusieurs études ont rapidement confirmé que celui-ci est capable de provoquer la contraction de l'artère coronaire (Kaumann et al., 1994; Ferro et al., 1995; pour revue MaassenVanDenBrink et al., 1998). Chez certains patients, l'administration de sumatriptan a même provoqué des crises cardiaques (Dahlof et Mathew 1998; Otterwanger et al., 1997: pour revue MaassenVanOenBrink et al., 1998). Ceci a été le cas chez des patients présentant des pathologies

•

cardiovasculaires comme des obstructions de l'artère coronaire. l'administration de sumatriptan a donc été contre-indiquée à ces patients à risque. 1.32

Dans l'ensemble, le sumatriptan représente néammoins une avancée importante dans le traitement de la migraine par son apparente capacité à interférer avec les

•

mécanismes de la céphalée. Comprendre son mode d'action pourrait donc donner des informations cruciales sur les mécanismes biologiques impliqués dans le déroulement de la crise.

Dans le but d'améliorer les traitements, il est aussi important de comprendre quels sont les mécanismes qui provoquent ses effets secondaires et si ce sont les mêmes que ceux responsables de ses effets thérapeutiques.

Le sumatriptan et les hypothèses physiopathologiques sur la migraine:

Plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer les effets thérapeutiques du sumatriptan. Ces hypothèses s'appuient sur les deux principales théories physiopathologiques concernant la céphalée migraineuse.

Le sumatriptan et la théorie vasculaire de la migraine:

Les premières théories sur la migraine sont directement fondées sur l'observation des symptômes durant les crises de migraine. Ces hypothèses ont aussi été étayées par des études plus récentes (Nichols et al, 1990: Drummond and lance 1983; Friberg et la.. 1991) comme il sera détaillé ci-dessous. D'après l'apparente dilatation des vaisseaux sanguins céphaliques observée chez des patients et surtout la qualité pulsatile et lancinante qui caractérise la douleur migraineuse (Graham et Wolff, 1938), ces théories la définissaient comme un désordre affectant les vaisseaux sanguins de la tête. En effet. ceux-ci recoivent une riche innervation sensorielle et. contrairement au cerveau, sont très sensibles à la douleur (pour revue, Moskowitz, 1984). Une stimulation mécanique des vaisseaux extracérébraux comme par

•

exemple une vasodilatation excessive lors de la crise de migraine est susceptible

1.33

d'entraîner une stimulation des terminaisons sensorielles périvasculaires du nerf V

•

issues du ganglion de Gasser (TG) qui conduisent les influx nerveux nociceptifs vers le système nerveux central via le nucleus trigeminalis caudalis (voir schéma page suivante).

De nombreuses observations ont permis d'associer des phénomènes vasculaires à la douleur ressentie pendant la céphalée migraineuse. La douleur pulsatile de la migraine peut être reproduite par la stimulation électrique ou mécanique des artères méningées (Rayet Wolff, 1940) ou le gonflement de ballon intravasculaire dans la carotide interne ou l'artère cérébrale moyenne pour des procédures d'angioplastie

•

1.34

•

INNERVATION NOCICEPTIVE CEPHALIQUE

Vaisseaux sanguins sensibles à la douleur

1nflux nerveux descendant du TG

Influx nerveux descendant du CNS

Nucleus trigeminalis caudalis

Influx nerveux ascendant au thalamus

/

Terminaisons nerveuses entrant dans le Nucleus trigemina/is caudalis

Fibres nerveuses du TG

•

Adapté au Français de .. Critical Decisions in Headache Management" . par Giammarco. Edmeads et Dodick. 1998, éditeur B.C. Decker, Londres,

•

(Nichais et al., 1990). On a observé qu'au cours des attaques de migraine, un certain soulagement de la céphalée est obtenu par la compression mécanique des vaisseaux de la tête (Graham et Wolff, 1938). La comparaison de l'amplitude de la pulsation de l'artère temporale superficielle avec l'intensité de la douleur dans la tempe chez les migraineux indique que chez une grande proportion d'entre eux, la douleur est d'origine vasculaire (Drummond et Lance, 1983). Des observations plus récentes faites par sonographie au flux laser montrent une dilatation de 20% de l'artère cérébrale moyenne au cours des crises de migraine (Friberg et al., 1991).

C'est donc à la suite ces observations que le sumatriptan a été synthétisé en vue de traiter la migraine par vasoconstriction (Humphrey et al., 1988; Humphrey et Feniuk 1991; pour revue Beattie et al., 1994). C'est un agoniste des récepteurs 5-HT1 et sa capacité à soulager la migraine a été plus particulièrement associée (Humphrey et Goadsby, 1994) à sa propriété vasoconstrictrice des vaisseaux sanguins extracérébraux (Jansen et al., 1992) dilatés lors de la crise. Justement. il a été montré que l'administration de sumatriptan abolit la dilatation de l'artère cérébrale moyenne durant la céphalée et simultanément. soulage la douleur (Friberg et al., 1991 ).

D'après ces résultats, il était donc tentant de conclure à une origine vasculaire de la céphalée. Mais si une telle hypothèse se trouvait vérifiée, elle rendrait improbable le succès des recherches pour développer des composés dotés de propriétés thérapeutiques mais dépourvus d'effet vasculaire en particulier cardiaque. Cependant cela serait peut-être possible si c'étaient des récepteurs différents qui médiaient les effets du sumatriptan dans les vaisseaux sanguins céphaliques et coronariens.

•

1.36

•

Le sumatriptan et la théorie de l'inflammation neurogène

Depuis les premières expériences avec le sumatriptan, la théorie vasculaire de la migraine a été progressivement remise en cause au profit d'une implication primordiale de facteurs nerveux et de la théorie de l'inflammation neurogène (NI) proposée par Moskowitz et collègues (1979; pour revue Moskowitz, 1992). Cette hypothèse, si elle est vraie, ouvre la perspective à des traitements efficaces dirigés vers des cibles neuronales et évitant tout effet vasculaire.

Les doutes quant à un rôle causal de la vasodilatation dans la céphalée sont fondés sur les observations suivantes dont la plupart ont été récapitulées par Moskowitz (1993b): L'administration de puissants vasodilatateurs comme la papavérine ne produit pas de migraine. Des agents vasoconstricteurs plutôt que vasodilatateurs comme le sang issu d'hémorragies sous-arachnoïdiennes induisent des céphalées intenses. Chez les migraineux, il n'y a pas de relation consistante entre l'intensité de la douleur et celle de la vasodilatation (Andersen et al., 1988). Il n'y a pas non plus de différence consistante entre les changements de calibre vasculaire entre les périodes interictales et les périodes de crise (Zwetsloot et al., 1991) De plus, l'unilatéralité de la douleur ressentie par la plupart des migraineux peut difficilement être expliquée simplement par une vasodilatation. Elle évoque plutôt un effet médié par des structures latéralisées comme le sont justement les TG qui innervent les vaisseaux extracérébraux.

Les TG sont des ganglions sensoriels bipolaires et ainsi capables de libérer

•

antidromiquement des peptides vasoactifs par leurs terminaisons périvasculaires. 1.37

•

C'est cette dernière propriété qui en font des éléments clefs de la théorie de l'inflammation neurogène (Moskowitz et al., 1979, pour revue Moskowitz.1992). Celleci postule que ce sont la libération et les effets dans !es méninges du peptide dérivé du gène de la calcitonine (CGRP). de la substance P (SP) et de la neurokinine A (NKA). abondants dans le TG, qui sont à l'origine de la douleur ressentie pendant la migraine.

Le CGRP est doté de puissantes propriétés vasodilatatrices grâce à son action directe sur le muscle lisse vasculaire. La SP et la NKA sont, elles aussi. vasodilatatrices grâce à leur effet sur l'endothélium mais présentent en outre des propriétés proinflammatoires et nociceptives qui en font des molécules de choix pour rendre compte de la douleur migraineuse.

En périphérie. la SP est connue pour son rôle dans la nociception et la promotion du phénomène d'inflammation neurogène.

un mécanisme de défense et de

détoxification de l'organisme (Lewis. 1937). Celle-ci est caractérisée par une vasodilatation accompagnée de dégranulation mastocytaire, une agrégation plaquettaire, une augmentation de la perméabilité vasculaire. une extravasation des protéines plasmatiques (PPE) et la formation d'oedème.

Moskowitz et collègues ont montré que la NI peut être produite dans les tissus méningés à la suite de la stimulation du TG (Moskowitz et al., 1979; Markowitz et al, 1987). Ils ont suggeré que ce phénomène serait responsable de la douleur ressentie dans les méninges lors de la crise de migraine. La vasodilatation n'y jouerait qu'un rôle secondaire, renforcant la stimulation déjà existante du TG et aidant au maintien de la nociception au cours des nombreuses heures que dure la migraine. Les facteurs responsables de la stimulation initiale du TG seraient d'origines variées comme des stimuli environnementaux ou physiologiques dont peut-être l'aura qui

•

1.38

•

précède certaines céphalées via la libération du vasodilatateur NO.

Moskowitz et collègues (Markowitz et al., 1987) ont mis au point un modèle animal permettant d'étudier la NI in vivo après stimulation électrique du TG. Ce modèle permet aussi de mesurer l'efficacité des composés pharmaceutiques à inhiber la PPE. Un grand nombre d'observations in vivo et in vitro sont venues appuyer la validité du modèle et la théorie de l'inflammation neurogène:

Premièrement, chez l'humain, une libération de CGRP et de SP peut être produite par stimulation du TG par électrocoagulation pour la thérapie de la neuralgie trigéminale. JI en est de même chez le chat après stimulation électrique du TG (Goadsby et al., 1988). En outre, lors de crises de migraines spontanées, la concentration de CGRP s'éleve dans le sang de la veine jugulaire externe (Goadsby et al., 1990). Cela n'est pas le cas dans la circulation périphérique ce qui indique une

libération locale céphalique (Shon et al., 1987).

De plus, dans le modèle animal de la NI, les composés efficaces pour le traitement aigu de la migraine comme les dérivés d'ergots (Markowitz et al., 1988) et le sumatriptan (Buzzi et Moskowitz, 1990) se sont avérés être de puissants inhibiteurs de l'extravasation des protéines plasmatiques. Les doses utilisées pour produire ces effets sont compatibles avec celles utilisées en clinique. Il est à noter que cet effet n'est pas la conséquence d'une action directe sur les vaisseaux mais bien sur les terminaisons nerveuses puisqu'il est complètement aboli par dénervation périnatale des afférences du TG.

•

1.39

•

Figure page suivante:

Mécanismes hypothétiques des effets thérapeutiques du sumatriptan. L'administration de sumatriptan pour le traitement symptomatique de la migraine entrainerait une contraction des vaisseaux extracérébraux dilatés pendant la céphalée et une inhibition de l'inflammation neurogène des tissus méningés. Cette dernière fait suite

à la libération de peptides vasoactifs comme le CGRP et la substance P à partir des terminaisons périvasculaires du TG stimulé pendant la migraine.

•

lAO

• Traitement symptomatique de la migraine (Modifi. d· ..... Hu.pluwyel Feaiut.I991)

MIGRAINE

t

Extravasation

•

Sensation douloureuse

Dilatation

TRAITEMENT Diminution de la douleur

t

Inhibition de r extravasation

•

Chez l'animal. la libération de CGRP suite à la stimulation électrique du TG est inhibée par l'administration de sumatriptan et de dihydroergotamine (Buzzi et al., 1991a). On a aussi observé chez les migraineux. que. lors des crises. l'administration de sumatriptan réduit la libération de CGRP dans la circulation crânienne (Goadsby et Edvinsson, 1993).

Les récepteurs impliqués dans l'inhibition de l'inflammation neurogène sont probablement nombreux car beaucoup de composés sont actifs dans ce modèle. Cependant. le rôle des récepteurs de la S-HT est évident. Ils ne sont pas de type S-HT2 ou S-HT3 vue l'absence d'effet de leurs antagonistes respectifs. la kétanserine et l'ICS205930. La puissance des effets obtenus par le sumatriptan indique plutot un rôle majeur des récepteurs S-HT1 dont il est un agoniste (Buzzi et al.. 1991 b; Moskowitz, 1992). De plus, une étude moléculaire a montré la présence de l'ARN pour le récepteur 5-HT1 D mais pas le S-HT1 B dans le TG chez l'humain (Rebeck et al.. 1994) indiquant un rôle possible de ce premier.

Cependant, l'efficacité des agonistes des récepteurs 5-HT1 8/10 dans le modèle d'inflammation neurogène n'est pas en stricte corrélation avec leur affinité à ces récepteurs. Par exemple, le CP 122, 288 . un analogue du sumatriptan et doté d'une affinité similaire aux récepteurs S-HTl 8/1 D. s'avère beaucoup plus puissant que celui--ci (Lee et Moskowitz. 1993). Il est donc probable que d'autres récepteurs de la S-HT sont impliqués dans les effets observés. A cet égard, il est intéressant de noter que le sumatriptan présente en particulier une haute affinité pour le récepteur S-HT1 F (Adham et al.. 1993) dont la distribution et le rôle dans le système trigéminovasculaire sont encore totalement inconnus au commencement de cette étude.

•

Dans l'état des connaissances disponibles au début de cette thèse. les différents lA2

•

récepteurs du sumatriptan viennent d'être identifiés. Les récepteurs 5-HT1 B et 5HT1D viennent d'être differenciés par la biologie moléculaire en dépit de leur très forte similarité pharmacologique et le récepteur S-HT1 F vient d'être cloné.

Moskowitz et collègues (Rebeck et al., 1994) affirment que le récepteur S-HT1 0 est présent dans le TG mais pas le récepteur 5-HT1 B. Par ailleurs, des études pharmacologiques et moléculaires suggèrent que le récepteur 5-H T1B serait responsable des effets vasculaires des agonistes 5-HT1 (Hamel et al., 1993a; 1993b). Ces observations soulignent la possibilité de développer des composés antimigraineux agonistes sélectifs des récepteurs S-HT1 0 qui n'agiraient que sur le tissu nerveux et seraient dépourvus d'effets secondaires.C'est donc, si elle est vérifiée, une situation prometteuse dans la perspective de développer de nouveaux traitements.

•

• AFFINITE DU SUMATRIPTAN POUR LES RECEPTEURS 5-HT1 SUMATRIPTAN

RECEPTEUR

plCSO/pKi

•

5·HT1A

6.0

5·HT1B

7.9

5·HT1D

7.9

5·HT1E

5.6

5·HT1F

7.6

D'après Adham et al., 1993; Humphrey et al., 1989 et McAllister et al., 1992. 1.44

•

En ce qui concerne le traitement symptomatique de la migraine, deux questions principales restent donc à résoudre: quelle est l'identité des récepteurs du sumatriptan exprimés dans les tissus impliqués et dans quelle mesure sont-ils responsables des effets cliniques ou secondaires du sumatriptan?

La première question sera l'objet des deux premiers articles de cette thèse. Les réponses à la seconde seront apportées par le deuxième article et les indispensables essais cliniques menés par les compagnies pharmaceutiques pendant cette période.

Le deuxième volet de cette thèse concerne l'étude des mécanismes d'action des antimigraineux utilisés en prophylaxie. Ces expériences ont donc été commencées après l'étude des récepteurs S-HT1 et la revue de la littérature mentionnera donc des études un peu plus tardives.

Les récepteurs S-HT2B/2C et l' hypothèse de leur rôle étiologique

Par corrélation pharmacologique Fozard et collègues ( Fozard, 1990; 1992: Kalkman 1994) ont montré que les médicaments parmi les plus utilisés pour la prophylaxie de la migraine avaient en commun leur affinité aux récepteurs S-HT2. De plus, le mchlorophenyl pipérazine (m-CPP), un métabolite de l'antidépresseurtrazodone, induit des migraines typiques (Brewerton, 1988) quand il est administré à une dose où il exerce un effet agoniste seulement sur les récepteurs S-HT2B/2C (Fozard, 1994: Fozard et Kalkman 1994). Par ailleurs, l'antagoniste des récepteurs S-HT2A ketansérine s'est montré sans valeur thérapeutique contre la migraine (Mylecharane. 1991; Winther, 1985). C'est donc une implication des récepteurs 5-HT2C ou 5-HT2B

•

qui a été suggérée. Fozard et collègues (Fozard et Gray, 1989: Fozard. 1995) ont

IA5

•

donc proposé un rôle de ces récepteurs dans l'étiologie de la migraine. Selon cette hypothèse, les antagonistes des récepteurs S-HT2B/2C exerceraient leurs effets thérapeutiques en inhibant des récepteurs situés sur l'endothélium des vaisseaux cérébraux et capables d' entraîner une libération de NO à partir de ce tissu. Ce composé est en effet doté à la fois de propriétés vasodilatatrices ou directement nociceptives (Wei et al., 1992) qui pourraient jouer un rôle dans la crise de migraine.

Le NO (pour revue voir Moncada, 1991) est un gaz lipophllique d'une durée de vie de seulement quelques secondes et qui pénètre facilement à travers les membranes cellulaires, entrainant la production de GMP cyclique dans le cytosol des cellules. Il est produit dans un grand nombre de tissus et synthétisé par trois types de synthases, les NOS l, Il et III à partir de son précurseur, la L-arginine, et en présence du cofacteur nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP). La NOS présente dans les macrophages (NOS Il) est inductible et produite principalement lors des réactions inflammatoires. Elle est capable de libérer des quantités importantes de NO et de façon soutenue. Au contraire. les NOS présentes dans l'endothélium et le tissu nerveux (type III et 1 respectivement) sont exprimées constitutivement dans ces cellules. Leur activation dépend de la présence de Ca2+calmoduline dans le cytosol ce qui est souvent une réponse à des stimuli comme l'activation des récep~eurs H1 de l'histamine ou des facteurs de stress physiologique comme l'hypoxie ou des changements de flux sanguin et elles ne produisent en general que de faibles quantités de NO de façon transitoire.

Dans les vaisseaux sanguins, la libération de NO produite à la suite de la stimulation des récepteurs 5-HT2B/2C entraînerait une vasodilatation qui pourrait jouer un rôle dans l'étiologie de la migraine. De fait. la présence de récepteurs 5HT2B/2C vasodilatateurs a été identifiée dans les vaisseaux périphériques (Bodelsson et al.,

•

1993: Ellis et al., 1995: Leff et al., 1987; Martin, 1993). De plus. dans les artères 1.46

•

cérébrales chez le porc, cette dilatation a pu être diminuée par un inhibiteur de la synthèse de NO (Schmuck et al., 1996). Que le récepteur impliqué soit de type 5HT2B ou 5-HT2C est difficile à déterminer à cause de leurs très forte similarité tant du point de vue pharmacologique que transductionnel (Martin et Boess, 1994; Bonhaus, 1995). Dans un grand nombre de ces études faites avant le clonage du récepteur 5-HT28 en 1994, c'est au récepteur 5-HT2C que ces propriétés vasodilatatrices étaient attribuées. Mais, le rôle du récepteur S-HT2B a été souligné par des études plus récentes comme celle montrant la dilatation de la veine jugulaire chez le rat (Ellis et al., 1995; Baxter ~\t al., 1995). La présence du récepteur 5-HT28 mais non celle du récepteur S-HT2C a aussi été démontrée dans une étude moléculaire sur des culture primaires de cellules endothéliales humaires dérivées de vaisseaux periphériques (Ullmer et al., 1995). Il reste à déterminer avec certitude quel est le récepteur qui joue le rôle le plus important dans les vaisseaux extracérébraux impliqués dans la migraine.

Ceci est d'autant plus intéressant que, dans les études menées chez l'humain. la capacité du NO à entrainer des attaques de migraines est un fait très bien établi (Sicuteri et al.. 1987: Olesen et al., 1993: Thomsen et al., 1994). En effet des études ont montré que l'administration de donneurs de NO comme la nitroglycérine (NTG) entraîne des attaques de migraine chez les migraineux mais seulement un faible mal de tête chez les scjets en bonne santé. Les migraines ainsi provoquées se produisent après un délai d'environ 5 heures et ont les caractéristiques typiques des crises spontanées à l'exception de l'aura (Olesen et al.. 1993; 1995). Chez les migraineux. la NTG induit une vasodilatation de l'artère cérébrale moyenne qui est plus forte que chez les sujets sains (Thomsen et al., 1993; 1994). De plus, il a été récemment montré que l'administration d'inhibiteur de la synthèse de NO chez les migraineux est un traitement efficace de leur céphalée dans les 2 tiers des cas

•

(Lassen et al.. 1997: 1998). Ces expériences laissent donc peu de doutes quant à

1..17

•

l'implication du NO dans l'étiologie de la migraine.

L'hypothèse Que ce NO soit d'origine endothéliale est appuyée par des résultats qui montrent que l'histamine agissant sur ses récepteurs H 1 localisés dans l'endothélium des artères cérébrales humaines (Ottosson et ar, 1988; Toda et al., 1990) s'avère, elle aussi, une puissante inductrice de migraine chez les migraineurs (Krabbe et Diesen 1980). Cependant il est encore possible que, lors de la migraine, le NO soit aussi libéré à partir des tissus nerveux et produit par la NOS de type 1.

Il reste donc d'abord à élucider quel(s) récepteur précisément médie(nt) les effets des antagonistes S-HT2B/2C utilisés en prophylaxie.

Par ailleurs, il apparaît important d'évaluer la localisation de ces récepteurs non seulement dans les tissus vasculaires mais aussi nerveux car ces derniers semblent jouer un rôle prépondérant dans les phénomènes associés à la migraine et seraient susceptibles d'être une importante source de NO.

De plus, bien que les observations associant d'une part effets cliniques et antagonisme aux récepteurs S-HT2B/2C et d'autre part effets cliniques et NO soient consistantes, il reste à confirmer le lien entre

récepteu~

S-HT2B/2C et NO pour

mieux évaluer sa signification clinique.

Les études décrites dans l'article 3 prennent avantage des techniques de biologie moléculaire et de la disponibilité récente du seul anticorps dirigé contre le récepteur S-HT2B humain pour étudier ces questions.

•

l.ol8

• CHAPITRE 2

FONDEMENTS ET OBJECTIFS DE LA THESE

•

2.1

•

Le but de cette étude est de clarifier quels sont les récepteurs impliqués dans l'étiologie et le déroulement de la pathologie migraineuse et de comprendre quels pourraient être leurs effets vasculaires et neuronaux. Il s'agit an particulier de savoir quels sent les récepteurs dont la stimulation pourrait être responsable des effets thérapeutiques et des effets secondaires des médicaments antimigraineux.

Les études exposées ici ont été effectuées sur des tissus humains en utilisant les techniques de biologie moléculaire. réactivité vasculaire in vitro. immunohistochimie et histochimie pour caractériser les récepteurs présents dans ces tissus. leur localisation et leurs effets fonctionnels.

Les lignes directrices de cette étude ont été dessinées par les indications données par la pharmacologie des médicaments antimigraineux. qui sont à présent les plus solides indications disponibles sur les mécanismes impliqués dans la migraine.

Les hypothèses actuelles sur les mécanismes qui sous-tendent l'effet thérapeutique du principal traitement symptomatique. le sumatriptan, lors de la crise de migraine proposent deux types d'effets:

un effet vasoconstricteur des vaisseaux

extracérébraux et un effet inhibiteur sur la libération des peptides issus du ganglion de Gasser. En outre, le sumatriptan présente des effets secondaires notamment cardiaques qui pourraient être dus à un effet vasoconstricteur sur l'artère coronaire. Il est donc critique de déterminer s'il est possible de synthétiser des médicaments ne touchant que le ganglion de Gasser et dépourvus d'effets vasoconstricteurs. Cela requiert de connaitre quets sont les récepteurs du sumatriptan dans chacun des tissus impliqués et s'ils sont susceptibles de médier ses effets secondaires.

•

2.2

•

Les questions spécifiques qui ont été abordées ont été les suivantes:

-Le ganglion de Gasser et les vaisseaux extracérébraux expriment-ils les mêmes récepteurs du sumatriptan ou existe-t-il une distribution différente de certains récepteurs entre les tissus nerveux et vasculaire?

-Quelle est la contribution de ces différents récepteurs à la contraction des vaisseaux extracérébraux ?

-Ces récepteurs sont-ils exprimés dans l'artère coronaire où ils pourraient exercer un effet similaire et être ainsi impliqués dans les effets cardiaques du sumatriptan ?

Les études pharmacologiques indiquent que les antagonistes des récepteurs 5HT28 ou S-HT2C présentent des propriétés prophylactiques antimigraineuses. Au contraire. l'administration d'un agoniste de ces récepteurs, le m-CPP, provoque des céphalées migraineuses typiques chez les sujets susceptibles. Pour expliquer ces effets. il a été proposé que la stimulation des récepteurs de type S-HT2B ou S-HT2C entraîne le début de la crise migraineuse en provoquant une libération de NO à partir de l'endothélium des vaisseaux extracérébraux. Néammoins. ni l'identité ni la localisation précise de ces récepteurs n'ont été démontrées dans le ganglion de Gasser et les vaisseaux extracérébraux humains.

Les questions suivantes ont donc été examinées:

-Quels sont précisément les récepteurs impliqués dans la prophylaxie migraineuse? Sont-ils de type S-HT2B ou S-HT2C dans le ganglion de Gasser

•

et les vaisseaux extracérébraux ? 2.3

•

..Quelle est la localisation cellulaire de ces récepteurs dans ces deux tissus et quelle pourrait en être la signification fonctionnelle?

..Ces récepteurs pourraient-ils être associés à la libération de substances vasoactives à partir du TG jouant un rôle dans la vasodilatation ou même un rôle plus large dans la nociception ?

•

•

CHAPITRE 3

Differentiai expression of sumatriptan-sensitive 5-hydroxytryptamine receptors in human trigeminal ganglia and cerebral vessels

Bouchelet l, Cohen Z, Case B. Séguéla P et Hamel E

publié dans le journal

&4

Molecular Pharmacotogy"

50:219-223 (1996)

Réimprimé avec la permission de la Société Américaine de Pharmacologie et de

•

Thérapeutiques Expérimentales. 3.1

•

SUMMARY The efficacy of sumatriptan in migraine relief has been attributed to its irteraction with 5-HT 1D receptors in cerebral blood vessels and/or on nerve endings of the trigeminovascular system in the dura mater. Using the high sensitivity of polymerase chain reaction (PCR) amplification, we investigated the expression of the sumatriptan-sensitive 5-HT receptors, namely the 5-HT 1 Q.l' 5-HT 1DB and S-HT'F subtypes in human trigeminal ganglia (n=10) and cerebral blood vessels (n=7) obtained post-mortem.

Messages for the 5-HT,[)& and 5-HT 1DB reœptors were

expressed in ail but one of the ten trigeminal ganglia studied. Expression of the 5HT, F receptor was detected by gel electrophoresis of the PCR products in six gangfia and by Southern blot hybridization in two additional cases. In human brain vessels, message for the 5-HT'DB was present in ail samples while specifie PCR products corresponding to the 5-HT lO ? reeeptor couId hardly be evidenced in only two preparations. PCR products indicative of 5-HT'F reœptor message were detected by gel electrophoresis in three brain vessel preparations and confirmed in the other four by Southem blot hybridization. Restriction mapping and sequence analysis of ail PCR products identified the expected human 5-HT receptor ONA sequences. The data confirm that the 5-HT'DB is the dominant species in human cerebral blood vessels and further show that this receptor, together with the 5-HT 'F. are expressed in bath neural and vaseular tissues. In contrast, the data point to a preferential expression of S-HT 1[)1 receptors in neural versus vascuJar tissues and strongly reemphasize the need for selective 5-HT, 0.& agonists in the identification of the target tissue(s) for antimigraine drugs. Moreover, the data stress the importance to better understand the raie of 5-HT'F receptors in cerebrovascular functions and durai inflammation and further raise interest for their possible involvement in migraine therapy.

•

~

.,

J._

•

INTRODUCTION Sumatriptan, originally deveJoped as a selective agonist at the 5-HT '-hke receptor mediating vasoconstriction (1), has proven to be highly effective in the acute treatment of migraine headache (2). Two mechanisms have been proposed ta explain its antimigraine activity. The tirst one has been attributed to the ability of sumatriptan to induce contraction of cerebral blood vessels (3.4) white the second relies on its effective blockade of durai inflammation mediated by trigeminovascular afferents (5). The nature of the receptor involved in these respective vascular and neurogenic responses ta sumatriptan has been investigated and evidence points to the 5-HT 10 receptor (for reœnt review see 6,7) which consists of two molecular variants, identified as the 5-HT lD,and 5-HTlD~ receptorsubtypes, in man (8.9). Using pharmacological correlates and Northem blot hybridization, we iaentified the 5-HT 10 (10) and more specifically the

5-HT1D~

subtype (11,12) as the receptor mediating

vasoconstriction ofhuman cerebral blood vessels. Similarly, pharmacological studies in animal models of durai inflammation suggest that a pre-synaptic 5-HT 1 ~ke reœptor (13,14), and possibly another subtyPe not yet identified (15,16), is involved in blockade of this neurogenic response. In man, molecular biology data using reverse transcriptase-polymerase chain reaetion (RT-PCR) amplification showed the presence of 5-HT,Du' but not 5-HTlD~' message in two out of eight human trigeminal ganglia (17). If true, such a tissue and function selectivity for the two 5-HT lD receptor subtypes would offer tremendous potential in drug design and in identitying which, if any, of the two praposed mechanisms is important in aborting migraine attack. However. besides the 5-HT lDtl and 5-HT1DB receptor subtypes far which it has a similar affinity (respective pK, of 8.5 and 8.1; 6), sumatriptan also exhibits relatively high affinity for the more recently cloned 5-HT 1F receptor (pK

= 7.6;

18). It is thus

possible that this receptor represents an additional therapeutic target for sumatriptan

•

and other related antimigraine drugs.

•

We therefore examined the expression of mRNA transcripts for these three sumatriptan-sensitive 5-HT, reœptors in human trigeminal ganglia and cerebral blood vessels by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) amplification. Our results indicate that the three sumatriptan-sensitive receptors are expressed in human trigeminal gangHa with ooly the 5-HT'oG and 5-HT'F species being clearry present in cerebral blood vessels. These findings underscore the importance of obtaining selective pharmacological too's to functionally discriminate the

trigeminal

receptor

from

the

S-HT 'OB

receptor

mediating

cerebral

vasoconstriction. Part of these results have appeared in abstract form (19).

MATERIALS AND METHOOS

Tissue preparation: Tissue sampJes were obtained post-mortem (6-24 hr) from either male CJr female human adult subjeets of various ages who died from diseases not related to the central nervous system. Trigeminal ganglia were removed from the skull base of ten subjects, cleaned of any contaminating dura or other tissues, and frozen at -SOC until use. Cerebral blood vessels were obtained from seven subjects. four of them corresponding to those from whom we obtained the trigeminal gangria (ganglia 5,10,9 and 8 on Figure 1 corresponding to vessels 1,2,3 and 6 on Figure 3, respectively). In ail cases, vessers corresponded to distal ramifications of major basal arteries and to small pial vessels overtying the cortical mantle of both cerebral hemispheres. They were kept in ice-cold phosphate buffered saline (pH 7.4) white being isolated from the pia-arachnoid membrane. They were frozen in liquid nitrogen and powdered with a pestle before further processing.

RNA isolation: Tissues were homogenized in TRlzol Reagent (Gibco BRL) using a polytron (Brinkmann) and total RNA extraeted based on the method described by Chomczynski (20). The RNA samples (-100-150

~g

per ganglion or vessel

extraction) were treated with RQ1-DNAase (Promega) during 15-30 min at 37C and

•

the readions terminated using phenol extraction. The RNA was then precipitated in ethanof and resuspended in water. 3.4

•

Oligonucleotide primers: For each receptor, specific oliganucleotide primers were designed according to published sequences (Weinshank et al., 1992; Adham et al. , 1993). They were flanked with the T7 (S'-GGTAATACGACTCACTATAGGGCGA-3') and SP6 (S'-CTCGGATITAGGTGACACTATAGAATAC-3') RNA palymerase promotor sequences for use in other experiments. Oligonucleatides were synthesized in an AppHed Biosystems synthesizer and purified using an OPC column (Applied Biosystems).

The

primers

were

as

follows:

5-HT 1D '

L

(1D'lF,

5'-

CACCATCTACTCCACCTGTG-3' and 1D.l R, S'-CAGAAATCCrCTTGCGTTC-3'), defining a 340 bp fragment of DNA including the ragion from the fifth transmembrane domain to the third intracellular loop of the receptor. AAGCCTTCTCCTCAAGCA-3' and

5-HT 1DB (1DBF, 5'-

1DBR, S'-AGGTGATGAGCGCCAATA-3'),

encompassing a 595 bp DNA fragment including the region from the S'-untranslated sequence to the first transmembrane domain of the receptor.

S-HT 1F (1 FF. 5'-

CTTGAAGCCnCTCTGAACTG-3' and 1FR. S'-AGAGATGCAAGATGGAGCAC-3'), providing amplification of a DNA fragment of 482 bp from the S'-untranslated region of the gene to the third transmembrane domain of the receptor.

RT-PCR amplification: cDNAs were synthetised (1 hr, 42C) trom 5-30 JJg of total RNA using random primers and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase. A control reaction lacking the reverse transcriptase enzyme was also prepared for each RNA sample and used in PCR analysis as described below to monitor for potential DNA contamination of the RNA sample5. The cDNA was amplified with Taq DNA polymerase using primers selective far each receptor. The reaction mixture contained 1-S JJI of cDNAs samples. 0.2 mM of each dNTP. 5% DMSQ, 1-3 mM MgCI2 , 2-5 units ofTaq DNA polymerase in 50 mM KCI, 10 mM tris-HCI, 0.1% Triton X-100 and 0.5-1 JJM of each primer in a total valume of 50 JJI.

The PCR was

performed in a MJ re5earch minicycler under the fallowing conditions: 2 min at 95C,

•

Smn at 72C, and 40s at 95C, 405 at 55C, 40s at 72C far 40 cycles, followed by a 5 min final extension at 72C. Ali amplifications were run two to three times on different

3.5

•

occasions and they were found to be highly reproducible from experiment to experiment.

Analysis of PCR samples:

Ali PCR derived fragments were electrophoretically

separated on a 1.70/0 TBE agarose gel containing ethidium bromide and photographed under UV light. When not visible by gel electrophoresis, PCR reaction products far the

5-HT1~

receptor fragment were further analysed by Southem blot

hybridization. The electrophoresed ONA was transferred ta a N+ nylon membrane (Amersham) by ovemight capillarity blotting in 0.4 N NaOH. The membrane was prehybridized 1 hr at 42C in a buffer containing 50% formamide, 5X SSC, 10 mM Tris, 1X Oenhardt's, 10/0 50S, 100/0 dextran and 100

~g/ml

salmon sperm DNA. The

hybridization was carried out at 42C in the same buffer with a 32P-labelled (1-5 106 cpm/ml) cDNA probe synthesized from the full coding sequence of the 5-HT1F reœptor (kindly provided by Dr. R. Hen, Columbia University, New York) generated by randam priming (Multiprime kit. Pharmacia). This DNA fragment overlaps the expected 5-HT 1F PCR product over 343 bp. Following an ovemight hybridizatian, the membranes were washed at low (25C, 2X SSC, 0.10/0 SOS) ta high stringency (SSC. 0.1 X SSC, 0.1 % SOS) and placed in cassettes for exposure ta Kodak XAR film. This was not performed for the 5-HT 1Du PCR products since a significant difference between reversed transcribed and non-reversed transcribed RNA samples could not be achieved in vascular samples not readily detectable on the gel (this is weil illustrated in fines 1 and 5 of Figure 3).

Restriction mappina and sequence analysis: Ali PCR produets were extraeted from agarose using the Glassmax DNA extraction kit (Gibco). Their identity was verified by restriction enzyme analysis. The PCR produets were incubated (1 hr. 37C) with enzymes which each yielded two or three fragments of predicted size on gel

•

electrophoresis. Each PCR product was digested separately as follows: 5-HT1Ou : Sau 3al (2 fragments of 92 and 248 bp each) and Hind III (2 fragments of 273 and 676 bp each); 5-HT 1D~: Pvu Il (2 fragments of 242 and 353 bp each) and NCol (2 3.6

•

fragments of 385 and 210 bp each) and 5·HT ,F : Sau 3al (3 fragments of 132, 110 and 210 bp each) and Ode 1(3 fragments of 147,262 and 736 bp each). In addition, the PCR fragments were subcloned into the M13mp19 vector and their nucleotide sequence determined using the Sanger dideoxy-nucleotide chain termination method and Sequenase (United States Biochemical) in an automated sequencer (ALF, Pharmacia).

RESULTS RNA isolated from each trigeminal ganglion was coneurrently treated for PCR amplification of the three sumatriptan-sensitive 5·HT, receptors. PCR products of the expected size for the 5-HT 1Otl or 5-HT'OB receptor subtypes (Figure 1) were identified in ail gangtia but one which interestingly, was not the same for the two reœptor subtypes (Iines 1 and 6 in Figure 1). From the same pool of 9anglia, six yielded PCR products corresponding to the 5-HT1F receptor visible by gel electrophoresis while expression of this receptor in two of the remaining ganglia was confirmed by Southem blot hybridization (Figure 2). Cerebral blood vessels corresponded ta various size arteries free of the arachnoid membrane.

The three reœptor messages were amplified trom the

individual reversed transcribed RNA samples. A specifie signal for the 5-HT ,Du subtype could hardly be evidenced by gel electrophoresis in two cerebral blood vessel extracts (Iines 2 and 3, in Figure 3), but ail cerebrovascular preparations exhibited PCR products corresponding in size to the 5-HT,oB receptor (Figure 3). With the exception ofthree vascular preparations (Iines 4.5 and 7 in Figure 3), PCR produets of the expected size for the 5-HT'F receptor were not detected by gel electrophoresis. Addition Southem blot hybridization with a 32P-labelled cDNA probe complementary ta the human S-HT1F receptor gene confirmed the presence of S-HT1F message in the remaining four human cerebrovascular preparations (Figure 2). Restnction mapping of the PCR produets generated in human trigeminal ganglia and cerebral blood vessels for the three receptors yielded fragments of the expected molecular size for each receptor (for details. Figure 4). In addition. 3.7

•

sequencing data from the PCR products fitted unambiguously the published sequences fortheir respective receptors: The identity was 98.S o/0, 96.7 % and 99.1 0/0 for the ~-HTlOn.' 5-HT,oB and 5-HT'F receptors, respectively. Such small variation being in the expected range of acceptability in single-strand sequencing analysis.

DISCUSSION The present data provide unequivocal evidence for the expression of 5-HT, Du, 5-HT'DB and S-HT'F receptors in human trigeminal ganglia. thus supporting the presence of pre-junctianal sumatriptan-sensitive 5-HT 1 receptors in the human trigeminavascufar system, as dacumented in animal models (far review, 5). However. our results only partly agree with thase of Rebeck et al. (17) who reported selective expression of 5-HT,O sumatriptan = 15-159 »> PNU-109291

= LY344864.

The contractions elicited by S-HT and sumatriptan in bovine vessels were antagonized by GR127935, which induced

a

rightward shift in the dose-response

curve to both agonists, together with a small but significant decrease in maximal responses for 5-HT (28 %

,

p< 0.001 at 10-6 M) and sumatriptan (21 %, p< 0.05) at the

highest antagonist concentration (Figures 3 and 4). The mean

p~

value calculated

for ail GR127935 concentrations against 5-HT was 8.06 ± 0_18. Schild plot analysis (r =0.99) of the inhibition yielded a pA:z value evaluated at the intercept of 7.89 (Figure 38). An overall pA:z value of 7.98 ± 0.12 (50) was thus obtained for GR127935 against 5-HT. When sumatriptan was used as the agonis!, GR127935 was a slightly more potent antagonist in inhibiting the contractile response with a calculated the

p~

p~

value of 8.50 ± 0.39 (Figure 4A). In the Schild plot analysis (r= 0.96),

value at intercept was 8.73 (Figure 48), for an overall

p~

value of 8.61 ±

0.12 {SOl.

S.HT1 receptor mRNAs expression in human coronary arteries Upon gel eleetrophoresis, PCR produds of the expeeted size for the S-HT, D receptor were never detected in human coronary arteries despite successful amplification in control tissue (Figure 5). In contras!, the 5-HT'B receptor message was strongly 4.9

•

expressed in a majority (>60 %

)

of human coronary arteries and messages for the 5-

HT, F receptor were deteded in about 40 0k of human coronary arteries. The intensity of the latter PCR products, however, was systematically very faint on the ethidium bromide-stained agarose gels (Figure 5).

Discussion The present data with selective S-HT,D, S-HT 18/1 Dand 5-HT ~ F= receptor agonists allow to conclude that the S-HT, B receptor is the exclusive mediator of the cerebral constriction elicited by sumatriptan and pharmacologically related compounds in bath bovine and human brain arteries at basal tone. Furthermore, the results indicate that this receptor subtype is expressed in a majority of human coronary arteries, in which it is most likely responsible for the reported arterial vasoconstriction elicited by sumatriptan and other non-selective 5-HT 1 reœptor agonists (Kaumann et al., 1994; Ferro et al. 1995; Maassen VanDenBrink et al.. 1998). Altogether these results suggest that selective 5-HT, Dand/or 5-HT 1F receptor agonists, if proven clinically effective, could represent a new generation of antimigraine compounds with a neuronal site of action and an increased cardiovascular safety.

The 5-HT, receptof agonist sumatriptan was found to elicit a contraction of bath human and bovine cerebral arteries, with a potency similar ta that reported in previous studies in human (Parsons 1991; Hamel et al. 1993b), bovine (Hamel et al., 1993b) and dog (Beattie & Connor, 1995) cerebral arteries. In bovine cerebral arteries, the maximal response elicited by sumatriptan and other 5-HT, receptor agonists was predictably less than that of S-HT, but was also slightly smaller than that reported previousJy by us for sumatriptan in the same preparation (Hamel et al., 1993b), probably a consequence of the seasonal variations in contractile S-HT receptors (Vinall et al., 1991). The difference between S-HT and sumatriptan maximal response, however, is most likely due ta the participation of S-HT'2A

·t 10

•

receptors in the S-HT-mediated vasoconstriction in this species (Frenken & Kaumann. 1984; De Wever et al. 1990; Foy et al. 1992), a population of receptors which is either not present or not functional in human brain vessels (Hamel & Bouchard, 1991: Kaumann et al., 1993). The vasocontractile response to S-HT in bovine cerebral arteries was inhibited by the non-selective S-HT 1 receptor antagonist GR127935 with an overatl potency

(p~ =

8) which was slightly less than that

observed when sumatriptan was used as the agonist (pA2

:.:

8.6). The fact that, in

bovine vessels. S-HT also interacts with 5-HT2A receptors for which GR127935 has a lower affinity (pKi of7.4) as compared to 5-HT 1811D receptors (Skingle et al., 1996), most likely aceaunt for this weaker potency of GR127935 against 5-HT. Interestingly, GR127935 potency against sumatriptan in bovine vessels was identical to that observed for this antagonist against sumatriptan in ovine main branch (pKb

=8.5)

and second branch (pKb = 8.7) middle cerebral arteries (Teng et al.. 1998), and compared very weil with that reported at rodent 5-HT 1B receptors (pKi = 8.5) (Skingle

et al., 1996) . However, it was slightly less than expected trom a previous study in the dog basilar artery where it behaved as a very potent insurmountable antagonist (Skingle et al., 1996). These apparent discrepancies in potency and type of antagonism in dog cerebrovascular tissues may be partiy related to species differences but could also be due to the fact that. in the present study. most vessels were exposed only once to this highly lipophilic antagonist in order to avoid tachyphylaxis, a phenomenon which would artificially increase the antagonist potency. The cerebrovascular potency of GR127935 in bovine vessels is thus fully compatible with an interaction with fundional5-HT 18110 receptors. and not with 5-HT 1F receptors for which it exhibits much lower affinity (pKi of 7.1, pers. comm. Dr. H. Connor).

..t Il

•

The vasocontractile response obtained with alniditan and/or 18-159, two compounds not structurally related to sumatriptan and with low or no affinity at the 5-HT 1F reœptor subtype (respective pKi values of 6 and
A88REVlAT1ONS: 5-HT, 5-hydroxytryptarn'ne; RT-PeR, reverse transeriptaSe-polymerase chain reaction; SSC. standard saline citrate; SOS. sodium dodecyt sulfate; bp, bue peir(s).

211

220

lIGue. . . . et eL

obtaiDed throu8h RT-PCR amplification IIhowed the presence oC 5-HT lDa, but DOt 5-HT lD,., me. . . . iD two oC eight human tripminal ganalia (17). Ir true. BUch a tiuue and funetion selectivity for the two 5-HT lD receptor Bubtype8 would offer tremendoua potential in drue deei8n and in identifying which. if any. of the two propoeed mechaniBDUI ie important in aborting migraine attaclL However. in addition ta the 5-HT Hm and 5-HT 101t receptar subtypes for which it has a similar aftinity
1_1421-1428 (19911. 1•. Lee. W.S.• aad"'A.~~~ .....cnptan . . . . . . . . CP.I22.288 . . CP-122.838 nbibit . h....... po&ezICy apiDat aeunpDic iDftaaauDaeiall iD dura mater. Braüa Ra.