M2 TES COUMOUL.pdf

Un exemple de toxicologie mécanistique et systémique : l’étude des mécanismes d’action de la dioxine.

X. Coumoul INSERM UMR-S 747 (Toxicologie, Pharmacologie et signalisation cellulaire)

Stress d’exposition aux xénobiotiques Différentes réponses

Réponse spécifique adaptative Métabolisme des xénobiotiques

Autres réponses Réponse générale adaptative

Voir plus loin

Contrôle du cycle cellulaire Apoptose

Chacune de ces réponses peut conduire à une toxicité

Metabolisme des xénobiotiques (simplifié) Xénobiotique

Phase I

OH

Phase II

O-Conj

Phase III O-Conj

CYP

Dioxines

TetraChloroDibenzoDioxine: TCDD - Famille de molécules plus ou moins chlorées - Planes, très lipophiles, très stables dans l’environnement et dans l’organisme - Furanes: structure similaire mais 1 seul O - HAP: Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (benzo(a)pyrène) - PCB: PolyChloroBiphényls - Propriétés similaires mais non identiques

Origine et transmission de la dioxine

- Origine industrielle: industrie chimique, papier, incinération d’ordures ménagères - Contamination directe ou de la chaîne alimentaire (ex: viandes, poissons, produits laitiers: transmission par le lait de vache et le lait maternel) - Stockage dans le tissu adipeux - Demi-vie: 7 ans

Effets toxiques des dioxines sur l’animal et l’Homme

Toxicité chez l’animal Etudiée principalement chez les rongeurs, plus récemment chez le singe

- Reproduction et Développement: diminution de la fertilité, tératogénicité (fente palatine, organogenèse dentaire). Chez le singe: fœtotoxicité et endométriose - Effets anti-œstrogéniques - Effet cancérogène bien établi (cancérogène complet: initiateur &promoteur)

- Immunosuppression - Toxicité aiguë: DL50 très variable selon les espèces

La dioxine est elle cancérogène chez l’homme?

Etudes épidémiologiques: chez les travailleurs exposés (synthèse de produits chimiques chlorés) chez les populations accidentellement contaminées (Seveso)

Augmentation significative mais modérée du risque (40%) pour tous types de cancers (pas de localisation spécifique) Pour Seveso, une tendance à l’augmentation a été observée ces dernières années (plus de 20 ans après)

Autres effets chez l’homme  Dermatologiques: chloracné  Maladies cardiovasculaires et élévation des lipides sanguins

 Diabète  Reproduction et Développement: nombreux effets rapportés selon les études (modification du “sex ratio”, diminution de fertilité, quelques malformations: émail dentaire). • Effets observés y compris pour des expositions modérées. Confusion possible avec les PCBs.

 Autres effets: données peu cohérentes

Caractéristiques des effets chez l’homme • Pathologies diverses • Cancers de localisations non spécifiques • Facteur de risque modéré • Dans certains cas, possibilité de confusion avec d’autres contaminants: PCB, Benzo(a)pyrène (tabac) Le rôle de la dioxine est probable en raison des observations chez l’animal:

 Pathologies similaires à celles de l’homme  Rôle clair de la dioxine  Rôle du récepteur AhR

Quels mécanismes d’action ?

Les effets transcriptionnels de la dioxine

• Il existe un récepteur de haute affinité pour la dioxine et les HAP • Aryl hydrocarbon receptor (AhR) • La dioxine contrôle l’expression de nombreux gènes • Effet direct ou indirect du AhR

• Les gènes des EMX sont les gènes cibles les mieux caractérisés • EMX: enzymes du métabolisme des xénobiotiques • Le CYP1A1 (une EMX) est induit de manière précoce et puissante • Induction plus modérée pour d’autres cibles (CYP1B1 et CYP1A2) • Problème: la dioxine est un très mauvais substrat de ces CYP (implications sur la demi-vie et toxicité)

Structure du AhR

bHLH

PAS

TAD

Liaison ADN Dimérisation

Transactivation Liaison ligand

Structure similaire à d’autres facteurs transcriptionnels de la famille PAS: HIF, Clock, Per, ARNT, Sim….

TAD

Voie de transduction du AhR Cl Cl

ARNT

ARNT AhR

AhR

AhR

CYP1, EMX

XRE

XRE : Xenobiotic Responsive Element

O

Cl

O

Cl

Dioxine

Toxicité chez l’animal (suite) Mécanismes: - L’étude des souris déficientes en récepteur AhR montre:  Les effets géniques et la survenue de cancers et de malformations dépendent de ce récepteur  Ce récepteur a un rôle endogène: hépatique, thymique, fertilité, cardiovasculaire

- Il existe des différences de sensibilité des espèces animales qui ne sont pas simplement expliquées par le récepteur:  Rôle de la toxicocinétique  Autres mécanismes




Ligands (dioxines, furanes, PCBs…)

AhR Gène X

Effets directs Gène Y

CYP1A1 Effets indirects

Gène Z Cascade transcriptionnelle




Régulation de l’expression des gènes par la dioxine

1- Gènes du métabolisme des xénobiotiques: phase I: CYP1A1, CYP1A2, C YP1B1 phase II: NQO1, GSTA, UGT1A6, Aldh 2- Autres gènes: cytokines inflammatoires, facteurs de croissance,…



• Les gènes des EMX sont les gènes cibles les mieux caractérisés • EMX: enzymes du métabolisme des xénobiotiques • Le CYP1A1 (une EMX) est induit de manière précoce et puissante • Induction plus modérée pour d’autres cibles (CYP1B1 et CYP1A2) • Problème: la dioxine est un très mauvais substrat de ces CYP

Comment expliquer la toxicité de la dioxine ?

Rôle des gènes cibles de AhR

Premières hypothèses: le rôle du métabolisme des EMX Balance entre protection & risque

Métabolisme du benzo(a)pyrene (BP) Diol-époxyde (mutagène)

Benzopyrène CYP1A1

E.H. O

CYP1A1 HO

HO OH

GST

O

UGT

OH

GST

.

Importance d’un bon équilibre entre les différentes EMX

CYP1 EPH MPO

BP

GST UGT

iBPox

BPconj NQO1

Toxicité

+

+++

-

Un déséquilibre entre les activités des enzymes de phase I et de phase II conduit à une accumulation d’intermédiaires très toxiques.

L’induction des CYP et des gènes de phases 2 par la dioxine active le métabolisme du BP

Autre effet potentiel des EMX: Stress oxydant

Réaction catalytique optimale

XH

XOH

CYP O2

H2O

XH

XH

Substrats découplés

CYP O2

H2O2

L’induction des EMX ne peut pas expliquer l’ensemble des toxicités des ligands du AhR

Stress d’exposition aux xénobiotiques Différentes réponses

Réponse spécifique adaptative Métabolisme des xénobiotiques

Autres réponses Réponse générale adaptative

Métabolisme endogène

Contrôle du cycle cellulaire

Migration

Apoptose Omiques, …

Chacune de ces réponses peut conduire à une toxicité

Une thématique de l’équipe 1 de notre unité (INSERM UMR-S 747)

S’incrivent dans ces politiques générales de recherche Axées sur une meilleure compréhension des mécanismes d’action des xénobiotiques

Xénobiotiques

?

Toxicités

Comment identifier de nouveaux gènes potentiellement responsables de toxicités ?

Systèmes haut-débit: omiques

Illustration d’un travail mené au laboratoire: AhR et plasticité cellulaire

AhR et plasticité cellulaire Historiquement:

Dioxines

Techniques - Culture cellulaire - Biologie moléculaire

Modèles - lignées humaines

EMX (CYP,…) Stress oxydant

AhR

? Transcriptomique Autres gènes

Gènes impliqués dans la migration et l’invasion cellulaire

HEF1, SOS1, AGR2,…

Morphologie cellulaire et dioxine

MCF-7: cellule cancéreuse mammaire

Diry et al, Oncogene 2006

Transition épithélio-mésenchymateuse

• E-Cadherine: marqueur épithélial membranaire • JNK: kinases activées par divers stress (EMT) • Rôles importants: développement, métastases

Progression tumorale ou dissemination métastatique

Morphologie cellulaire et dioxine

Diry et al, Oncogene 2006

Dioxine et mobilité cellulaire Test d’adhésion

Test de blessure

Dioxine et activation de JNK

T2.3: expression conditionnelle d’un récepteur AhR constitutivement actif

Rôle joué par le AhR dans ces phénomènes

Bui, Tomkiewicz et al, Oncogene 2009

AhR et plasticité cellulaire Historiquement:

Dioxines

Techniques - Culture cellulaire - Biologie moléculaire

Modèles - lignées humaines

EMX (CYP,…) Stress oxydant

AhR

? Transcriptomique Autres gènes

Gènes impliqués dans la migration et l’invasion cellulaire Identifiés dans la lignée HepG2 cellule cancéreuse hépatique

Gènes identifiés

INSERM UMR-S 747: gènes de la migration et de l’invasion

Gene

Rôle de la protéine

Induct° par dioxine

HEF1

Integrin signaling Metastatic marker

5

AQP3

Aquaporin

10

SOS1

Regulation RAS/RAC

5

AGR2

?

10

HEF-1 (Human enhancer of Filamentation) ou NEDD9

Structure -protéine de la famille Cas -Cas: Crk associated Substrate -Isolé d’un « screening » effectuée chez la levure

Expression - principalement dans lymphocyte, poumon, épithélium mammaire - 2 formes principales 105 kDa et 115 kDa (forme hyperphosphorylée) Rôle

- cycle cellulaire (fuseau mitotique, Aurora A) - apoptose (inducteur ou marqueur ?) - surexpression corrélée avec progression tumorale et invasion cellulaire (marqueur métastatique)

Cas: un relais pour les intégrines

Intégrines Milieu extrac. Relais Voies de signalisation

Régulation du gène HEF1 par la dioxine


La régulation de HEF1 par la dioxine dépend du AhR


Rôle de HEF1 dans les effets du AhR ?


Rôle de HEF1 dans les effets du AhR ? (2)


Rôle de HEF1 dans les effets du AhR ? (3)


Conclusion de cette étude Dioxines & HAP

AhR

Migration & invasion ?

Morphology & Adhesion

E-Cadherin regulation JN Kinase regulation

Epithelial Mesenchymal Transition (EMT) ?

Cell migration

Rôle de l’environnement progression tumorale ?

Plasticité cellulaire et AhR -La génomique (puces à ADN) a montré que la dioxine contrôle l’expression d ’ un grand nombre de gènes. Certains sont impliqués dans la motilité cellulaire: HEF-1, Sos-1, serpin-1, p27, MKP etc…

-Dans C. elegans, le récepteur AhR est impliqué dans la mobilité et la différentiation neuronale; chez la drosophile, Spineless (orthologue du AhR) est impliqué au cours du développement

- Problème de développement chez les souris AhR KO - Problème de développement chez les souris AhR + TCDD - Rôle de la régulation du AhR dans le développement (EMT ?) ?

Quelques conclusions  Régulation des EMX par le AhR: n’explique pas toutes les toxicités  Apport des omiques dans la découverte de nouveaux rôles  Convergence avec d’autres études: exemples des KO • souris (problème de développement) • invertébrés (rôle du AhR dans le développement; Persistance d ’ une fonction ancestrale?)

 Autres aspects intéressants du AhR: • rôle différentiel des ligands

 Expositions chroniques à faible dose

INSERM UMR-S 747 – Team 1 Team 1 Robert BAROUKI Chantal BENELLI Xavier COUMOUL Toxicologie, métabolisme et signalisation cellulaire M AGGERBECK - CR1 R BAROUKI - PUPH2 E BLANC - MCF B CHADEFAUX-VEKEMANS -MCUPH1 J-F CHASSE - MCUPH2 X COUMOUL - MCF M-A LE-FRERE BELDA – PH A-S BATS - PH F LECURU - PUPH2 C OTTOLENGHI - AHU H ROUACH - PR1 S SANQUER - PE C TOMKIEWICZ-RAULET –IE B LE-GRAND - TCH IE L-C BUI - POST-DOC M KIM - POST-DOC A AMBOLET-CAMOIT - PhD A CHEVALLIER - PhD E GUYOT - PhD S PIERRE - PhD

C BENELLI - CR1 C FOREST - DR2 J-L BRESSON - PUPH1 B DURANT - MCF M-JAUBERT - MCF

S BORTOLI - IGR M COLLINET - AI G PENOT - POST-DOC

F NIANG – PhD C PERRIERE – M2R

Merci de votre attention !!