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Effects of different resistance exercise intensity on mitochondrial DNA deletions in young athletes

IN C ER O V P A Y R M IG E H DI T C ® A

Effetti di diverse intensità di esercizio di resistenza sulle delezioni di DNA mitocondriale in giovani atleti R. RAHIMI 1, Z. SALEHI 2, Z. MOUSAVI BENEH-HOOR 2

1Department

of Physical Education and Sport Sciences, University of Kurdistan, Sanandaj, Iran 2Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran

SUMMARY

Aim. The purpose of the present study was to examine the effect of resistance exercise (RE) with different intensities on mitochondrial DNA deletions including 4977-bp (mtDNA4977 deletion), 8.7 kb, 7.5 kb and 7.4 kb deletion in young athletes. Methods. Ten resistance-trained men (age: 21±2.30 year; weight: 74.71±8.73 kg; height: 175.14±5.95 cm) performed high intensity RE (4 sets of 5 exercises at 90% of 1RM with 3 min rest between sets) and moderate intensity RE (4 sets of 5 exercises at 75% of 1RM with 1 min rest between sets) on a separate occasion in a counterbalanced order. Blood samples were obtained before (Pre) and immediately after (Post) RE for analyzing mtDNA deletions in blood leucocytes by multiplex polymerase chain reaction (PCR). Results. The results indicated that 8.7 kb, 7.5 kb, 7.4 kb and mtDNA4977 deletion, were not evident in leucocytes at Pre and Post during both RE intensities. Conclusion. In conclusion, our findings showed that RE did not induce mtDNA deletions in resistance trained men, probably because of adaptations occurring owing to chronic resistance training. Key words: Mutation - Resistance training - Oxidative stress.

RIASSUNTO

Obiettivo. Obiettivo del presente studio è stato quello di esaminare l’effetto di diverse intensità dell’esercizio di resistenza (ER) sulle delezioni di DNA mitocondriale, inclusa la delezione a carico della coppia di basi n. 4977 (delezione mtDNA4977) e le delezioni di 8,7 kb, 7,5 kb e 7,4 kb in giovani atleti. Metodi. Dieci uomini allenati alla resistenza (età: 21±2,30 anni; peso: 74,71±8,73 kg; altezza: 175,14±5,95 cm) hanno effettuato un ER ad alta intensità (4 serie di 5 esercizi con carico al 90% di 1RM e 3 minuti di riposo tra le serie) e un ER di moderata intensità (4 serie di 5 esercizi con carico al 75% di 1RM e 1 minuto di riposo tra le serie) in momenti separati e in ordine controbilanciato. I campioni ematici sono stati prelevati prima (pre) e immediatamente dopo (post) l’esercizio di resistenza per analizzare le delezioni di mtDNA nei leucociti ematici mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) multiplex. Risultati. I risultati hanno indicato che le delezioni di 8,7 kb, 7,5 kb, 7,4 kb e di mtDNA4977 non erano evidenti nei leucociti nel pre- e post-ER a entrambe le intensità. Conclusioni. Per concludere, i nostri risultati hanno mostrato che l’ER non ha indotto delezioni di mtDNA negli uomini allenati alla resistenza, probabilmente a causa degli adattamenti verificatisi a causa dell’allenamento cronico della resistenza.

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MED SPORT 2013;66:315-24

Parole chiave: Mutazione - Esercizio di resistenza - Stress ossidativo.

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here is a growing body of evidence indicates that an acute bout of intense exercise increase reactive oxygen species (ROS) genera-

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i è una crescente quantità di evidenza che indica come una sessione acuta di esercizio fisico intenso aumenti la produzione di specie

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Resistance exercise intensity

reattive dell’ossigeno (ROS), conducendo all’ossidazione delle macromolecole 1-5. È stato suggerito come i mitocondri siano la principale fonte intracellulare di produzione di ROS, come l’anione superossido o i radicali idrossilici 6, 7. Tali ROS sono generate come normali sottoprodotti della catena di trasporto degli elettroni e la loro produzione aumenta durante l’esercizio fisico 1, 4. I mitocondri sono un importante organulo intracellulare e sono essenziali per la respirazione e la fosforilazione ossidativa della cellula. I mitocondri possiedono il proprio genoma (mtDNA) che è composto da una molecola circolare a doppio filamento lunga 16.569 bp che codifica 13 polipeptidi essenziali della catena respiratoria, 2 RNA ribosomiali e 22 RNA di trasferimento 8. Inoltre, evidenze sperimentali dimostrano che le mutazioni di mtDNA sono il risultato dello stress ossidativo 8, 9. È stato dimostrato che la mutazione di mtDNA è circa 10 volte maggiore rispetto al DNA nucleare (nDNA) e ciò è dovuto alla più elevata concentrazione di ROS nei mitocondri, a inefficaci meccanismi di riparazione del DNA e all’assenza di istoni protettivi 10. Adachi et al. 11 hanno fornito la prima evidenza diretta per mostrare che le ROS sono responsabili dell’occorrenza delle delezioni di mtDNA. Essi hanno dimostrato che una delezione di 4 kb nel mtDNA è stata generata nei cardiomiociti attraverso la somministrazione intraperitoneale di doxorubicina in topi Balbc. È noto che la doxorubicina induce la formazione di radicali liberi nel cuore e stimola la formazione di anioni superossido nei mitocondri 12. In base a tali ragioni, è possibile presupporre che il mtDNA sia più soggetto a danneggiarsi in condizioni di stress ossidativo 10 e che tale danneggiamento possa verificarsi a causa dello stress ossidativo indotto dall’esercizio fisico 13. Tra le mutazioni di mtDNA, una delle più importanti per lunghezza e frequenza è una singola delezione, quella a carico della coppia di basi n. 4977 del mtDNA (mtDNA4977) che si verifica in diversi tipi di carcinomi umani 14-18. La delezione di mtDNA4977 (delezione comune) rimuove un terzo del genoma essenziale del mtDNA, compresi geni strutturali della catena di trasporto degli elettroni (ATPasi 8, ATPasi 6, citocromo ossidasi III, subunità 3 della NADH deidrogenasi [ND3], ND4L e ND4) e cinque geni per tRNA 19. Una maggiore mutazione di mtDNA si verifica spesso negli esseri umani con l’avanzare dell’età 9 ed è stata associata a diverse malattie degenerative associate all’età avanzata 14, 20, 21. Nonostante l’importanza della delezione di mtDNA4977 nella produzione di energia nel corso dell’esercizio fisico, i dati disponibili non sono definitivi e solo pochi studi sembrano avere affron-


tion leading to macromolecule oxidation.1-5 It has been suggested that the mitochondria are the major intracellular source of ROS generation such as superoxide anion or hydroxyl radicals.6, 7 These ROS are produced as normal byproducts of the electron transport chain and its production increased during exercise.1, 4 Mitochondria are an important intracellular organelle that are essential for respiration and oxidative phosphorylation of the cell. Mitochondria have own genome (mtDNA) which is composed of 16,569-bp circular double-stranded molecule that encodes 13 essential polypeptide of the respiratory chain and 2 ribosomal RNAs and 22 transfer RNAs.8 In addition, experimental evidence demonstrates that mtDNA mutations are supposed to be a result of oxidative stress.8, 9 It has been shown that the mtDNA mutation is about 10 times more than the nuclear DNA (nDNA) which is due to the higher concentration of ROS in mitochondria, ineffective DNA repair mechanisms, and the absence of protective histones.10 Adachi et al.11 provided the first direct evidence to show that ROS are responsible for the occurrence of mtDNA deletions. They demonstrated that a 4 kb deletion of mtDNA was generated in the cardiomyocytes by intraperitoneal administration of doxorubicin to Balbc mice. It is known that doxorubicin induces formation of free radicals in the heart and stimulates superoxide anion formation in mitochondria.12 Based on these reasons; it is possible to postulate that mtDNA is more susceptible to damage under oxidative stress 10 and it may be occurring due to exercise-induced oxidative stress.13 Among mtDNA mutations, one of the most important by its length and frequency is one single deletion, the 4977 bp deletion of mtDNA (mtDNA4977), which is occurring in different types of human cancers.14-18 The mtDNA4977 deletion (common deletion) removes one-third of the essential mtDNA genome which include structural genes of electron transport chain (ATPase 8, ATPase 6, cytochrome oxidase III, NADH dehydrogenase subunit 3 (ND3), ND4L, and ND4) and five tRNA genes.19 Increased mtDNA mutation frequently occurs in humans with aging 9 and has been associated with a number of age related degenerative diseases.14, 20, 21 Despite the importance of mtDNA4977 deletion in energy production during exercise,

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tato la delezione di mtDNA4977 dopo l’esercizio fisico 13, 22, 23. Sakai et al.13 hanno mostrato che l’esercizio fisico intenso (a una velocità di corsa di 40 m/minuto per 20 minuti) causa la delezione a carico della coppia di basi n. 380 del mtDNA nei muscoli scheletrici dei ratti rispetto a ratti di controllo, e hanno concluso che lo stress ossidativo indotto dall’esercizio intenso modifica il mtDNA. Tuttavia, Jafari et al. 24, hanno dimostrato che una sessione di esercizio fisico aerobico non causa la delezione di mtDNA nel muscolo scheletrico dei ratti. Inoltre, Huang et al. 25 hanno dimostrato che l’esercizio fisico estenuante (a una velocità di 30 m/minuto fino alla spossatezza) non ha avuto alcun effetto sulla delezione di mtDNA4834 nei tessuti epatici e muscolari di ratti giovani. Finora, sono stati condotti solo 3 studi che hanno esaminato l’effetto dell’esercizio fisico sulla delezione di mtDNA4977 negli esseri umani 22, 23, 26. Tuttavia, non esistono altri studi che abbiano esaminato altre delezioni di mtDNA come la delezione di 8,7 kb e 7,5 kb in risposta all’esercizio fisico estenuante. Iwai et al.23 hanno esaminato le variazioni dinamiche del DNA mitocondriale soggetto a delezione nei leucociti del sangue umano dopo l’esercizio di endurance in individui non allenati. Nel presente studio, la delezione di mtDNA4977 nei leucociti è stata rilevata prima del regime di esercizio fisico in tutti e cinque i soggetti, i quali conducevano tutti stili di vita normali, senza praticare attività sportive. Essi hanno dimostrato che la delezione comune nei leucociti scompare in un periodo di diversi giorni dopo l’esercizio di endurance e riappare diversi giorni dopo. Inoltre, Iwai et al. 22 hanno identificato la delezione di mtDNA4977 in calciatrici sane e hanno mostrato che l’assunzione di catechine del tè verde per 5 settimane ha causato una riduzione significativa della frequenza di delezione del mtDNA4977. Tuttavia, Mirzaei et al. 26 hanno esaminato l’effetto dell’allenamento aerobico sulla delezione di mtDNA4977 nei leucociti ematici di giovani uomini sani e non allenati. Essi hanno riportato come otto settimane di allenamento aerobico non abbiano indotto delezioni di mtDNA4977 nei leucociti del sangue umano. Sulla base delle conoscenze riportate dalla letteratura, nessuno studio ha finora esaminato l’effetto dell’esercizio di resistenza sulla delezione di mtDNA4977 e di 8,7 kb, 7,5 kb e 7,4 kb negli atleti. Pertanto, nel tentativo di migliorare la comprensione delle delezioni di mtDNA indotte dall’esercizio fisico, il presente studio è stato concepito per esaminare l’effetto dell’esercizio di resistenza, condotto a diverse intensità, sulle delezioni di mtDNA nei giovani atleti.


the available data are not conclusive and only a few studies appear to have addressed the mtDNA4977 deletion after exercise.13, 22, 23 Sakai et al.13 showed that acute exercise (at a running speed of 40 m/min for 20 min) causes the mtDNA 380-bp deletion in rat skeletal muscle compared to control rats, and concluded that the oxidative stress induced by acute exercise modifies mtDNA. However, Jafari et al.24 demonstrated that one session of aerobic exercise does not cause mtDNA deletion in rat skeletal muscle. Also, Huang et al.25 demonstrated that exhaustive exercise (at a speed of 30 m/min until exhaustion) had no effect on mtDNA4834 deletion of muscular and hepatic tissues in young rats. To date, there are only 3 studies to investigate the effect of exercise on the mtDNA4977 deletion in human.22, 23, 26 However, there aren’t any studies in relating other mtDNA deletions such as 8.7 kb and 7.5 kb deletion in response to exhaustive exercise. Iwai et al.23 examined the dynamic changes of the deleted mitochondrial DNA in human blood leucocytes after endurance exercise in untrained individual. In this study, the mtDNA4977 deletion in leucocytes was detected prior to the exercise regime in all five subjects, who were all living normal, exercise-free lifestyles. They demonstrated that the common deletion in leucocytes disappears over a period of several days after endurance exercise and reappears a number of days thereafter. Also, Iwai et al.22 identified mtDNA4977 deletion in healthy female soccer players and showed that drinking green tea catechins for 5 weeks caused the frequency of mtDNA4977 deletion to significantly decrease. However, Mirzaei et al.26 examined the effect of aerobic exercise training on mtDNA4977 deletion in blood leucocytes of untrained healthy young men. They reported that eight week aerobic training did not induce mtDNA4977 in human blood leucocytes. Based on literature knowledge, no studies, to date, have examined the effect of resistance exercise on mtDNA4977 deletion and 8.7 kb, 7.5 kb and 7.4 kb deletion in athletes. Therefore, in an attempt to progress in the understanding of exercise-induced mtDNA deletions, the present study was designed to investigate the effect of resistance exercise with different intensities on mtDNA deletions in young athletes.

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Materials and methods

Materiali e metodi Approccio sperimentale al problema

Experimental approach to the problem

Subjects

Le delezioni di DNA mitocondriale sono state determinate in protocolli di esercizio di resistenza (ER) a intensità elevata e moderata utilizzando un disegno randomizzato controbilanciato. Tutti i soggetti hanno agito come controlli di se stessi in un disegno crossover. Dieci uomini allenati alla resistenza (AR) sono stati assegnati in maniera casuale per partecipare a sessioni di ER, separate da 72 ore, che prevedevano 4 serie di 5 esercizi con carico al 90% di 1RM e 4 serie di 5 esercizi con carico al 75% di 1RM fino alla spossatezza. I campioni di sangue sono stati raccolti prima (Pre) e immediatamente dopo (Post) ciascuna sessione di ER per analizzare le delezioni di mtDNA nei leucociti ematici mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) multiplex.


Mitochondrial DNA deletions were determined to heavy- and moderate-RE protocols using a randomized, counterbalanced design. All subjects acted as their own controls in a crossover design. Ten resistance-trained (RT) men were randomly assigned to participate in bouts of RE, separated by 72 h, involving 4 sets of 5 exercises with 90% of 1RM and 4 sets of 5 exercise with 75% of 1RM until exhaustion. Blood samples were collected before (Pre) and immediately after (Post) each RE session to analyze mtDNA deletions in blood leucocytes using multiplex polymerase chain reaction (PCR).

Ten resistance trained men (age: 21.00±2.30 year; weight: 74.71±8.73 kg; height: 175.14±5.95 cm) who had at least 1 year experience in whole-body resistance training volunteered to participate in this study. The experimental procedure was explained in details to all subjects and they completed a written informed consent approved by the local institutional ethics committee. Subjects were on their ordinary diet, and did not consume anabolic steroids or any other anabolic agents known to increase performance. No subjects were smoker or used antioxidant supplementation.

Soggetti

Dieci uomini allenati alla resistenza (età: 21±2,30 anni; peso: 74,71±8,73 kg; altezza: 175,14±5,95 cm) che avevano almeno 1 anno di esperienza nell’allenamento della resistenza corporea si sono offerti volontari per partecipare a questo studio. La procedura sperimentale è stata spiegata nel dettaglio a tutti i soggetti, i quali hanno compilato il consenso informato scritto approvato dal locale Comitato etico dell’istituto. I soggetti seguivano una dieta ordinaria, senza consumo di steroidi anabolizzanti o di altre sostanze anaboliche note per aumentare la performance. Nessun soggetto era fumatore o faceva uso di integratori antiossidanti.

Experimental design

One week prior to the experimental resistance exercise workouts, subjects came to the Exercise Physiology Lab for measuring height, weight and one repetition maximum (1RM) for the bench press, leg press, seated bar shoulder press, arm curls and lat pull down exercises.3, 27 Prior to 1RM testing, all subjects performed warm-up, which consisted of 3 min running, 5-10 repetitions at 50% of perceived maximum strength and stretching period. The warm-up procedure was held constant throughout all the testing sessions. Each subject performed 2 RE protocols of different intensities in a randomized, cross-over design. At least 72 hours of recovery time were allowed between each training session. Subjects were instructed not to train or be involved in strenuous activ-

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Disegno sperimentale

Una settimana prima degli allenamenti sperimentali di esercizi di resistenza, i soggetti si sono recati presso il laboratorio di fisiologia dell’esercizio per la misurazione di altezza, peso e di una ripetizione massimale (1RM) per gli esercizi di bench press, leg press, shoulder press con bilanciere da seduti, arm curls e lat pull down 3, 27. Prima dei test di 1RM, tutti i soggetti hanno effettuato un riscaldamento, che prevedeva 3 minuti di corsa, 5-10 ripetizioni al 50% della forza massima percepita e un periodo di stretching. La procedura di riscaldamento è stata mantenuta costante per tutte le sessioni di test. Ogni soggetto ha effettuato 2 protocolli di ER a diverse intensità in un disegno crossover randomizzato. Tra le sessioni di allenamento sono state fatte passare almeno 72 ore di tempo di recupero. I soggetti sono stati istruiti a non allenarsi o


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prendere parte ad attività faticose per 48 ore prima o dopo la prova sperimentale di ER. Tutti i soggetti hanno completato due protocolli di ER composti da 4 serie di esercizi di bench press, leg press, overhead press con bilanciere da seduti, arm curls e lat pull down con un carico al 90% di 1RM e 3 minuti di riposo tra le serie e con un carico al 75% di 1RM e 90 secondi di riposo tra le serie; ciascuna serie è stata condotta fino alla spossatezza. Per garantire che tutti i soggetti si muovessero a circa la stessa velocità per ogni ripetizione, ogni serie è stata cronometrata utilizzando un cronometro portatile. L’osservatore stabiliva un ritmo per le fasi eccentriche e concentriche di ogni ripetizione. La velocità di ripetizione prevedeva una fase eccentrica di 3 secondi seguita da una fase concentrica di 1 secondo. Il volume di ogni esercizio è stato calcolato come numero di serie x ripetizioni completate x carico (kg).


ity for 48 hours before or after the experimental RE trial. All the subjects completed two RE protocols that consisted of 4 sets of the bench press, leg press, seated bar overhead press, arm curls and lat pull down exercises at 90% of 1RM with 3 min rest between sets and at 75% of 1RM with 90s rest between sets, and each set was performed to exhaustion. To ensure that all subjects were moving at approximately the same velocity for each repetition, each set was timed using a handheld stopwatch. The spotter called out a cadence for the eccentric and concentric phases of each repetition. The repetition velocity consisted of a 3-second eccentric phase followed by a 1-second concentric phase. The volume of each exercise was calculated as the number of sets × complete repetitions × load (kg).

Campionamento ematico ed estrazione di mtDNA

Blood sampling and mtDNA extraction

Blood samples were collected from each subject in a seated position from an antecubital vein into EDTA-containing tubes at pre and post RE bouts. Mitochondrial DNA was isolated from peripheral blood leukocytes using standard phenol-chloroform method by GPP™ Solution kit (Gen Pajoohan Pouya Co).

I campioni ematici sono stati raccolti da ogni soggetto in posizione seduta da una vena antecubitale in provette contenenti EDTA nelle sessioni pre- e post-ER. Il DNA mitocondriale è stato isolato da leucociti nel sangue periferico con il tradizionale metodo fenolo-cloroformio mediante il kit della soluzione GPP™ (Gen Pajoohan Pouya Co). PCR multiplex

Multiplex PCR

Multiplex PCR reactions were carried out using four sets of primers: ONP89/ONP86 with ONP74/ONP25, ONP10/ONP74 and ONP25/ ONP99 (Table I). ONP89 primer located at 57405721 bp and ONP86 located at 5461-5480 bp of the mtDNA were used to amplify a 279-bp fragment in a rarely deleted region as an internal control in each sample. ONP74 primer located at 13640-13621 bp and ONP25 located at 81618180 bp of the mtDNA were used to amplify a

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Le reazioni di PCR multiplex sono state condotte utilizzando quattro serie di primer: ONP89/ONP86 con ONP74/ONP25, ONP10/ONP74 e ONP25/ ONP99 (Tabella I). Il primer ONP89 ubicato a 5740-5721 bp e il primer ONP86 ubicato a 54615480 bp del mtDNA sono stati utilizzati per amplificare un frammento di 279-bp in una regione raramente soggetta a delezioni come controllo interno in ogni campione. Il primer ONP74 ubicato a 13640-13621 bp e il primer ONP25 ubicato a 81618180 bp del mtDNA sono stati utilizzati per amplificare una regione di 502-bp creata dalla delezione

Table I.—Position and oligonucleotide sequences of primers used in multiplex PCR amplification. Tabella I. — Posizione e sequenze oligonucleotidiche dei primer utilizzati nell’amplificazione mediante PCR multiplex.

Name of primer

Nucleotide position of primer

Primer sequence

ONP ONP ONP ONP ONP ONP

5461-5480 (ND2) 5740-5721 (OL) 15000-14981 (Cyt b) 13640-13621 (ND5) 8161-8180 (COII) 16150-16131B(D-loop)

5'- CCC TTA CCA CGC TAC TCC TA-3' 5'- GGC GGG AGA AGT AGA TTG AA-3' 5'- TTG GCG TGA AGG TAG CGG AT- 3' 5'- GGT TGA CCT GTT AGG GTG AG- 3' 5'- CTA CGG TCA ATG CTC TGA AA-3' 5'- GTG GTC AAG TAT TTA TGG TA-3'

86 89 10 74 25 99

(LF) (HB) (HB) (HB) (LF) (HB)

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Table II.—Primers position used in PCR amplification for detection of four mtDNA deletions. Tabella II. — Posizione dei primer utilizzati nell’amplificazione mediante PCR per la rilevazione di quattro delezioni di mtDNA.

Primers

ONP ONP ONP ONP ONP

86, ONP 86, ONP 25, ONP 25, ONP 86, ONP

10 74 74 99 99

Start point of primer

End point of primer

5461 5461 8180 8180 5461

15000 13640 13640 16150 5740

Length of deletion (kb)

Length of observed PCR product (bp)

8.7 7.4 5 7.5 -

839 680 502 470 279 (internal control)

di mtDNA4977. Il primer ONP86 e il primer ONP10 ubicati a 15000-14981 bp, il primer ONP86 e il primer ONP74, primer ONP25 e il primer ONP99 ubicati a 16150-16131 bp sono stati utilizzati per amplificare regioni create dalle delezioni di 8,7 kb, 7,5 kb e 7,4 kb (Tabella II) 28. Le distanze tra i primer erano abbastanza lunghe da permettere l’amplificazione solo se una parte del DNA tra i rispettivi primer era soggetto a delezione. La reazione di PCR è stata condotta in un volume totale di 25µl contenente: 100 ng di DNA totale, 10 pmol di ciascun primer, 2,5 mM MgCI2, 200 mM di ciascun dNTP, 2,5 µl di 10x PCR buffer e 1 U di TaqDNA polimerasi 28, 29. Il protocollo di PCR prevedeva un’iniziale temperatura di fusione di 94 °C (5 minuti) seguita da 35 cicli di amplificazione (1 minuto a 94 °C, 1 minuto a 57 °C, 40 secondi a 72 °C). Una fase di estensione finale da 10 minuti (72 °C) ha concluso il processo. I prodotti della PCR sono stati separati su gel di agarosio al 2%, sottoposti a corsa in 1xTBE a 95 V per 50 minuti, colorati in 0,1 µg ml-1 bromuro di etidio e visualizzati con luce ultravioletta.

Statistical analysis

Il test esatto di Fisher per l’indipendenza è stato utilizzato per confrontare le mutazioni di mtDNA prima e dopo entrambi i protocolli dell’esercizio di resistenza. Un valore P inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.


502-bp region created by the mtDNA4977 deletion. ONP86 primer and ONP10 primer located at 15000-14981 bp, ONP86 primer and ONP74 primer, ONP25 primer and ONP99 primer located at 16150-16131 bp were used to amplify regions created by 8.7 kb, 7.5 kb and 7.4 kb deletions (Table II).28 The distances between the primers were long enough to allow amplification only if a part of the DNA between respective primers was deleted. PCR reaction was carried out in a total volume of 25µL containing: 100 ng of total DNA, 10 pmol of each primer, 2.5 mM MgCl2, 200 mM of each dNTP, 2.5 µL 10× PCR buffer and 1 U TaqDNA polymerase.28, 29 The PCR protocol included an initial melting temperature of 94 °C (5 min) followed by 35 cycles of amplification (1 min at 94 °C, 1 min at 57 °C, 40 s at 72 °C). A final 10 min extension step (72 °C) terminated the process. PCR products were separated on 2% agarose gels, run in 1X TBE at 95 V for 50 min, stained in 0.1 μg ml-1 ethidium bromide and visualized by UV light.

The Fisher’s exact test of independence was used to compare mtDNA mutations before and after both resistance exercise protocols. A P value 0.05). Exercise volume completed during two RE protocols were shown in Figures 2 and 3.

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Analisi statistica

I campioni ematici sono stati analizzati per delezioni di mtDNA utilizzando la PCR multiplex (Figura 1). Non è stata osservata nessuna delezione di mtDNA nei campioni di leucociti ematici prima e dopo i protocolli di ER. Inoltre, i risultati non hanno rivelato nessuna differenza significativa nelle delezioni di mtDNA tra i test precedenti (pre) e successivi (post) a entrambi i protocolli di ER (P>0,05). Il volume dell’esercizio fisico completato durante i due protocolli di ER è illustrato nelle Figure 2 e 3.


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Figure 1.—Multiplex PCR products from 3 subjects for detecting 8.7 kb, 7.5 kb, 7.4 kb and mtDNA4977 deletion at pre and post RE protocols. Lane M: 100 bp DNA lader; Bands at 279 bp indicates internal control. Lanes Pre1 and Post1: PCR products from 75% of 1RM protocol; Lanes Pre2 and Post2: PCR products from 90% of 1RM protocol; Lanes Pre3 and Post3: PCR products from 75% of 1RM protocol. Figura 1. — Prodotti della PCR multiplex da 3 soggetti per la rilevazione della delezione di 8,7 kb, 7,5 kb, 7,4 kb e mtDNA4977 nei protocolli pre- e post-esercizio di resistenza (ER). Colonna M: DNA ladder 100 bp; le bande a 279 bp indicano il controllo interno. Colonne pre1 e post1: prodotti PCR dal protocollo con carico al 75% di 1RM; colonne Pre2 e Post2: prodotti PCR dal protocollo con carico al 90% di 1RM; colonne Pre3 e Post3: prodotti PCR dal protocollo con carico al 75% di 1RM.

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Figure 2.—Exercise volume in leg press (LP) and overhead press (OP) exercises at 90% of 1RM with 3 min rest between sets and at 75% of 1RM with 90s rest between sets. §Significant difference between protocols at P