Tesis - Universidad de Colima

UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE MEDICINA

“FRECUENCIA DE LOS POLIMORFISMOS DE LOS GENES CYP1A1 Y CYP1B1 EN MUJERES CON CÁNCER DE MAMA, EN JALISCO”

TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN CIENCIAS MÉDICAS PRESENTA:

Biol. Laura Janin Muñoz Islas Asesor de Tesis: Dr. en C. Ruth De Celis Carrillo Investigador Asociado “C” Centro de Investigación Biomédica de Occidente, IMSS Asesor de Tesis: Dr. En C. Elena Margarita Castro Rodríguez Investigador Titular “A” Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas Universidad de Colima

Colima, Colima, Julio 2010

Maestría en Ciencias Médicas

Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama

Instituciones donde se realizó el proyecto:

Laboratorio de Inmunología molecular de la División de Inmunología Centro de Investigación Biomédica de Occidente (CIBO) Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS)

Unidad Médica de Alta Especialidad No. 145 (UMAE) Centro Médico Nacional de Occidente (IMSS)

Hospital Civil, Fray Antonio Alcalde

Instituto de Cirugía Reconstructiva Secretaría de Salud. Guadalajara, Jalisco



INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL CENTRO DE INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA DE OCCIDENTE ONCOLOGÍA AMBIENTAL

Guadalajara, Jalisco a 28 de Julio del 2010

Dr. Carlos Enrique Tene Pérez Director de la Facultad de Medicina De la Universidad de Colima Presente

Por medio de este conducto quisiera hacer de su conocimiento que he revisado la tesis en su última versión de mi estudiante Laura Janin Muñoz Islas intitulada “Frecuencia de los polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama, en Jalisco” y verifique que las correcciones que les solicité fueran incorporadas al manuscrito, por lo cual, considero que es apta para su presentación en pleno con el afán de obtener el grado de Maestro en Ciencias. Sin mas por el momento, quedo de Usted

Atentamente,

Dra. Ruth De Celis Carrillo Mat. 8637954 Investigador Asociado “C” N52 Oncología Ambiental División de Inmunología Centro de Investigación Biomédica de Occidente CIBO IMSS Investigador Nacional Nivel I



UNIVERSIDAD DE COLIMA Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas

Colima, Colima 28 de Julio del 2010

Dr. Carlos Enrique Tene Pérez Director de la Facultad de Medicina De la Universidad de Colima Presente

Por medio de este conducto quisiera hacer de su conocimiento que he revisado la tesis en su última versión de mi estudiante Laura Janin Muñoz Islas intitulada “Frecuencia de los polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama, en Jalisco” y verifique que las correcciones que les solicité fueran incorporadas al manuscrito, por lo cual, considero que es apta para su presentación en pleno con el afán de obtener el grado de Maestro en Ciencias. Sin más por el momento, quedo de Usted Atentamente,

____________________________________ Dra. Elena Margarita Castro Rodríguez Investigador Titular “A” Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas Universidad de Colima





Agradezco de manera especial a: CONACYT por la beca No.252200 otorgada durante la Maestría en Ciencias Médicas, realizada en la Universidad de Colima. A la Universidad de Colima por abrirme sus puertas y brindarme la oportunidad de seguir con mi preparación académica y superación personal. Al Centro de Investigación Biomédica de Occidente (CIBO), por su apoyo incondicional durante mi formación



DEDICATORIAS A mis padres Felipe y Mary a quien amo y admiro, porque gracias a ellos hoy estoy aquí, por transmitirme la bondad, constancia y dedicación. Por su apoyo y confianza, sin ustedes no hubiera podido cumplir mis metas, esta tesis también es su premio. A Francisco Rico por ser mi fuerza y soporte, por su enorme comprensión y paciencia, pero sobre todo por quererme incondicionalmente. Gracias amor por impulsar mis sueños. A mis hermanos Edgar, Alejandra, Felipe y Héctor, por estar conmigo en todo momento y brindarme de su optimismo y entusiasmo, haciéndome ver siempre el lado positivo de las cosas. A mi cuñada y sobrinos con mucho cariño, porque me motivaron a seguir adelante.



AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Ruth De Celis Carrillo por todo lo que me ha enseñado y la confianza que ha depositado en mí; sus consejos, calidad humana, así como su dedicación han sido fundamentales para dar forma a este trabajo. A la Dra. Elena Margarita Castro por su disponibilidad y contribución a lo largo de la maestría. A mis asesores: Dra. Claudia Beltrán, Dr. Luis Felipe Jave, Dr. Alejandro Bravo y al Dr. Marco González gracias por su dedicación y apoyo a este proyecto. A Verónica Preciado Martínez por compartir conmigo no sólo conocimientos sino experiencias de vida, pero sobre todo por permitirme contar con su valiosa amistad todo este tiempo, muchas gracias por escucharme y estar siempre a mi lado. A Lupita, Elena y Paola por su oportuna participación y entusiasmo en este proyecto al hacer más ameno y agradable el trabajo diario. A mis profesores de la Maestría en Ciencias Médicas por sus conocimientos y experiencias brindadas.



ÍNDICE Índice de cuadros y figuras Abreviaturas Resumen Summary Introducción Antecedentes Polimorfismo y mutación Citocromo p450 Gen CYP1A1 Gen CYP1B1 Tóxicos Cáncer de mama Signos y síntomas del cáncer de mama Epidemiología del cáncer de mama Factores de riesgo para cáncer de mama Justificación Planteamiento del problema Pregunta de investigación Hipótesis Objetivos Objetivo general Objetivos particulares Material y Métodos Diseño de estudio Universo de trabajo Tamaño de la muestra Descripción de grupos de estudio Criterios de selección Criterios de inclusión Criterios de exclusión Variables Operacionalización de variables Descripción de las técnicas Extracción de ADN Integridad y pureza Detección de polimorfismos Amplificación por PCR Descripción de enzimas de restricción Análisis Estadísticos Consideraciones Éticas Resultados Discusión Conclusiones Perspectivas Anexos Anexo I. Carta de consentimiento informado Referencias Bibliográficas

1 2 3 5 5 6 8 8 9 11 13 13 15 19 19 19 20 20 20 20 21 21 21 21 22 22 22 22 23 23 24 24 28 32 34 35 36 36 37 43 47 49 51 53 55



ÍNDICE DE CUADROS Y FIGURAS FIGURAS Figura 1. Citocromo p450 Figura 2. Modelo 3D del gen CYP1A1 Figura 3. Modelo 3D del gen CYP1B1 Figura 4. Mamografía Figura 5. Producto amplificado del polimorfismo Ile462Val del gen CYP1A1 Figura 6. Producto digerido del polimorfismo Ile462Val del gen CYP1A1 Figura 7. Producto amplificado del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1 Figura 8. Producto digerido del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1 Figura 9. Frecuencias genotípicas y alélicas del polimorfismo Ile462Val del gen CYP1A1 en grupo con cáncer de mama y de referencia Figura 10. Frecuencias genotípicas y alélicas del polimorfismo Leu432Val

6 7 8 11 37 38 38 39 42

42

CUADROS Cuadro 1. Clasificación del carcinoma mamario de acuerdo a la OMS Cuadro 2. Principales causas de muerte en México 2005-2030 Cuadro 3. Factores que incrementan el riesgo de cáncer de mama Cuadro 4. Estrategias de detección de los genes de la familia CYP1 Cuadro 5. Condiciones de reacción para la PCR Cuadro 6. Condiciones de reacción para la digestión conenzimas de restricción Cuadro 7. Frecuencias genotípicas de los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en grupo con cáncerde mama y de referencia Cuadro 8. Frecuencias alélicas de los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en grupo con cáncer de mama y de referencia Cuadro 9. Determinación de equilibrio Hardy-Weinberg Cuadro 10. Determinación de Chi cuadrada y valor de P

12 14 17 31 32 40

40

41 41



ABREVIATURAS ºC A ADN AHH Art C CIBO CYP dNTPs EDTA G GST gr H Ile KCl Leu Lt MgCl2 mg mL µg µL min mM M ng nm NAT NaCl NH4Cl NH4NCO3 O2 Pb PCR PAHs RH RFLPs rpm SDS seg T Tris-HCl TE U Val

Grados centígrados Adenina Ácido Desoxirribonucleico Aryl hidrocarburos Artículo Citosina Centro de Investigación Biomédica de Occidente Citocromo p450 Desoxinucleótidos trifosfatados Ácido etilendiaminotetraacético Guanina Glutatión-S-transferasas Gramos Horas Isoleucina Cloruro de Potasio Leucina Litros Cloruro de Magnesio Miligramo Mililitros Microgramo Microlitros Minutos Milimolar Molar Nanogramos Nabometros N-acetiltransferasas Cloruro de sodio Cloruro de amonio Bicarbonato de amonio Oxígeno Pares de bases Reacción en Cadena de la Polimerasa Hidrocarburos aromáticos policíclicos Sustrato orgánico Fragmentos de restricción polimórficos en longitud Revoluciones por minuto Dodecilsulfato sódico Segundos Timina Tris-ácido clorhídrico Tris-EDTA Unidades Valina



RESUMEN Introducción. El citocromo p450 es responsable del metabolismo oxidativo de los xenobióticos. Su expresión es regulada por variabilidad genética, fisiopatológica

y

ambiental;

y

presenta

variabilidad

en

la

respuesta

farmacológica o diferente susceptibilidad a la acción de tóxicos o carcinógenos. Los genes asociados con el incremento de riesgo para desarrollar cáncer de mama son CYP1A1: (Ile462Val) y CYP 1B1: (Val432Leu). Objetivo. Estimar la frecuencia de los polimorfismos Ile462Val y Val432Leude los genes CYP 1A1 y CYP 1B1, en mujeres con cáncer de mama. Metodología. Estudio descriptivo transversal. Se analizaron muestras de sangre periférica de mujeres con cáncer de mama, pacientes de varias instituciones de salud en Guadalajara, Jalisco. Se obtuvo ADN de cada paciente, se identificó el tipo de polimorfismo por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando enzimas de restricción específicas para los genes CYP1A1 y CYP1B1, así como electroforesis en geles de agarosa. Resultados: Se estudió un total de 151 muestras de sangre periférica (76 grupo con cáncer de mama; 75 grupo de referencia). Se utilizó Chi cuadrada para el análisis estadístico. El polimorfismo que mayormente se presentó fue Ile462Val del gen CYP1A1 en 51 muestras del grupo con cáncer de mama (67.1%) y en 44 muestras grupo de referencia (58.6%); a diferencia del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1, el cual sólo se presentó en 25 muestras del grupo con cáncer de mama (32.9%) y en 31 de las muestras de referencia (41.3%). Aunque la frecuencia de las variantes de los genes estudiados no fue significativamente diferente a la reportada, concluimos que fue importante identificarlas debido a que podría ser factible considerarlo en la estimación de riesgo para desarrollar cáncer de mama y para contribuir a la información de toxicidad de ciertas sustancias. Palabras Claves: Citocromo p450, CYP1A1, CYP1B1, cáncer de mama, polimorfismos. 1



SUMMARY Background: Cytochrome p450 is responsible for the oxidative metabolism of xenobiotics.

Its expression is regulated by genetic, pathophysiological and

environmental variability in the response showing pharmacological or different susceptibility to toxic or carcinogenic action. The genes associated with increased risk of developing breast cancer are CYP1A1 (Ile462Val) and CYP 1B1 (Val432Leu). Objective. To estimate the frequency of polymorphisms Ile462Val and Val432Leu gene CYP 1A1 and CYP 1B1 in women with breast cancer. Methodology. Descriptive cross-sectional study. We analyzed peripheral blood samples of survivors of breast cancer from different health institutions in Guadalajara, Jalisco. DNA was

obtained from each patient, type was identified through polymorphism chain reaction (PCR) using specific restriction enzymes CYP1A1 and CYP1B1 genes and agarose gel electrophoresis. Results. We studied a total of 151 peripheral blood samples (76 breast cancer group, 75 control group). Chi square was used for statistical analysis. The polymorphism Ile462Val presented was mainly the CYP1A1 gene in 51 samples from breast cancer (67.1%) and 44 samples reference group (58.6%) Leu432Val polymorphism unlike CYP1B1 gene, which was only present in 25 samples from breast cancer (32.9%) and 31 reference samples (41.3%). Although the frequency of the variants of the genes studied was not significantly different from that reported, we conclude that it was important to identify because it may be feasible to consider in estimating the risk of developing breast cancer and to contribute to the toxicity of certain information substances. Keywords:

Cytochrome

P450,

CYP1A1,

polymorphisms.

2

CYP1B1,

breast

cancer,



INTRODUCCIÓN

En la actualidad, el cáncer de mama es la neoplasia diagnosticada con mayor frecuencia en las mujeres[3]. En México, de acuerdo al Registro Nacional de Cáncer, se estima que cada día mueren diez mujeres por esta enfermedad. En el 2005, se registraron 2,861 fallecimientos lo que representa el 21 por ciento, en comparación con el 19 por ciento a causa del cáncer cérvico-uterino [4]. Los principales factores de riesgo para desarrollar cáncer de mama son de tipo genético y ambiental. Estos últimos han despertado mayor interés [5] al observar su trascendencia en la etiología de algunos tipos de cáncer como próstata o mama [6]. Los efectos a la exposición a sustancias tóxicas son variados, por lo cual las personas no lo perciben como perjudicial para su salud [7-9]; sin embargo, para nuestra defensa disponemos de sistemas químicos como el citocromo p450, el cual tiene como función actuar sobre sustancias exógenaspara convertirlas en formas solubles de fácil excreción, evitando de esta forma que se acumulen en el organismo y alcancen concentraciones tóxicas o letales[2]. Dicho

sistema

se

encuentra

compuesto

por

varias

subfamilias

conformadas a su vez por genes, entre ellas:la Familia 1, constituida por: a) el gen CYP1A1 que contribuye a la desintoxicación de sustancias como los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs)[10] y a metabolizar estrógenos, su polimorfismo con mayor frecuencia es (Ile462Val) [11]. b) El gen CYP 1B1 que se encuentra involucrado en el metabolismo de PAHs y arilamidas cuyo polimorfismo más frecuente es (Val432Leu); ambos asociados con el incremento de riesgo para desarrollar cáncer de mama [12].

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ANTECEDENTES Polimorfismo y mutación

Un polimorfismo genético es una variación en la secuencia de un sitio específico del ácido desoxirribonucleico (ADN), debido a la coexistencia de alelos múltiples en un locus entre los individuos de una población [13]. Cuando se presentan en una secuencia codificante o reguladora, producen cambios importantes en la estructura de alguna proteína o en el mecanismo de regulación de su expresión, traduciéndose en diferentes fenotipos [14]. Consiste en la sustitución de una base nitrogenada o puede ser más complejo como la repetición de una secuencia determinada de ADN, donde un porcentaje de individuos tenga un número estipulado de copias de una secuencia específica del ADN [15]. Cuando la variación se observa en por lo menos el 1% de la población, se puede considerar como un polimorfismo [14]. Es importante destacar, que sólo un número muy pequeño de polimorfismos son responsables de enfermedades genéticas, la mayoría no tienen efecto sobre el fenotipo. Se conocen como: mutaciones, cuando los cambios en la secuencia de bases en el ADN son poco frecuentes, éstas son alteraciones en la información genética, que producen un cambio en las características, se presentan de forma súbita y espontánea, y pueden trasmitirse o heredarse a la descendencia [15]. La unidad genética capaz de mutar, es el gen, por poseer la información hereditaria que forma parte del ADN. Aunque la replicación del ADN es muy precisa, no es perfecta; algunas veces se producen errores, y el ADN nuevo contiene uno o más nucleótidos cambiados [14].

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Citocromo p450

En el curso de la evolución las especies se desarrollaron sistemas de defensa endógena que les permitió adaptarse y sobrevivir en hábitats y dietas diferentes. Para cumplir con este objetivo, el hombre y la mayoría de los seres vivos, poseen el sistema citocromo p450 (Fig.1) cuya misión es actuar sobre sustancias químicas exógenas, convirtiéndolas en formas solubles, fácilmente excretables, evitando que se acumulen en los organismos alcanzando concentraciones tóxicas o letales[2].Después de haber sido encontrado en diferentes tipos de organismo, se cree que tiene su origen en un gen ancestral que existió hace más de tres millones de años.

Fig. 1. Citocromo p450

El citocromo p450 una hemoproteína con un pico de absorbancia de 450nm, capaz de transportar electrones [2],funciona como una monooxigenasa que cataliza reacciones en las que solamente incorpora un átomo de oxígeno (O²) en un sustrato orgánico (RH) y el otro se reduce a agua (H²O). [16]. En general, las enzimas se clasifican en dos categorías: Fase I, que cumple la función de metabolizar; Fase II, que tiene la misión de conjugar los sustratos con otros compuestos [17]. El citocromo p450, es una enzima importante en el metabolismo de fase I, actúa dentro de las células en

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compañía de las enzimas fase II, entre las que se encuentran las glutation-Stransferasas (GST) y las N-acetiltransferasas (NAT). La mayor o menor actividad de unas y otras tiene como consecuencia que las sustancias exógenas que llegan a las células, resulten inocuas o tengan un efecto tóxico [2]. Por lo tanto, el citocromo p450 es el responsable de catalizar la hidroxilación de múltiples compuestos, así como del metabolismo de xenobióticos entre los que se encuentran diversas drogas, alcaloides, carcinógenos, pesticidas e hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) [2, 18, 19].

Fig. 2. Modelo 3D gen CYP1A1.

Éste sistema, participa activamente en el metabolismo oxidativo de una amplia variedad de compuestos endógenos talescomo: esteroides, ácidos grasos y prostaglandinas; asimismose encuentra implicado en la síntesis de sustratos [2, 18]. Las duplicaciones de genes repetidos han dado lugar a una de las mayores familias de múltiples genes.Las enzimas que incluye esta superfamilia CYP son: CYP1, CYP2, CYP3 y algunas enzimas de CYP4 [18]. La familia CYP1 está constituida por los genes CYP 1A1, CYP 1A2 y CYP 1B1. Los tres se caracterizan porque pueden ser activados por hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) [2, 20].

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El gen CYP 1A1(Fig. 2) constituye la mayor fracción del citocromo p450 extrahepático. Se localiza en el cromosoma 15 q22-q24, posee siete exones y seis intrones; esta conformado por 5,810 pares de bases, es una enzima dominante en la bioactivación de la fase I de los xenobióticos. Contribuye a la desintoxicación de numerosos compuestos, así como a la hidroxilación de los aryl hidrocarburos, catalizando la primera etapa del metabolismo de una gran variedad de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) [10]. Se encuentra implicado en el metabolismo del estrógeno, al catalizar la hidroxilación de 17ßestradiol en la posición C-2[10, 11, 21].

Fig. 3. Modelo 3D gen CYP1B1

El gen CYP 1A1 codifica para una enzima con actividad aryl-hidrocarburohidrolasa (AHH), que es inducible por ligandos de los receptores de arylhidrocarburos en casi todos los tejidos estudiados, entre los que se encuentran: linfocitos, tejido pulmonar, glándulas mamarias y placenta. Hasta la fecha han sido identificados diecinueve polimorfismos de este gen; uno de los más comunes es: CYP 1A1*2 el cual consiste en la sustitución de isoleucina en el codón 462 por valina (Ile462Val); se asocia con el incremento del riesgo de distintos tipos de cáncer: pulmón, mama, próstata y cérvico uterino [11]. Por otra parte, el gen CYP 1B1(Fig. 3) constituye también una fracción importante del CYP extrahepático con expresión en casi todos los tejidos, como son: riñón, próstata, glándulas mamarias y ovarios. Está localizado en el

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cromosoma 2p21-p22, constituido por tres exones y dos intrones; similar en tamaño al gen CYP1A1 cuenta con 8.546 pares de bases de longitud. Es una enzima que cataliza la formación de genotóxicos 4- hidroxiestradiol a catecol metabolito estrogénico por lo que posee una actividad estrogénica significativa, este metabolito puede experimentar un ciclo redox generando una mutación al producir radicales libres que pueden ocasionar cambios significativos en el ADN y otras estructuras celulares. Esta enzima también está involucrada en el metabolismo de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) y arilaminas y se ha sugerido su sobreexpresión en algunos tumores [12]. El gen CYP 1B1 presenta varios alelos, en la actualidad se han reportado 42 variantes y aquéllos con actividad enzimática reducida han sido asociados con glaucomas primarios congénitos[22]. El polimorfismo más común en CYP1B1 consiste en la sustitución de Valina en el codón 432 por Leucina (Val432Leu), este cambio se asocia directamente con el incremento de riesgo para desarrollar cáncer de mama [12, 23].

Tóxicos La mayoría de los tóxicos de uso frecuente son capaces de mutar al ADN y transformar a las células hasta entidades totalmente extrañas para el organismo, pueden ejercer efecto estrogénico sobre órganos o tejidos y pueden causar inmunosupresión en los organismos [4]. Existe una larga lista de sustancias tóxicas, las cuales son consideradas potencialmente peligrosas para la salud humana como son los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) un grupo de más de cien sustancias químicas diferentes, formadas durante la combustión incompleta del carbón, el aceite, el gas, la basura u otros compuestos orgánicos [24].

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Desde hace mas de cinco décadas los PAHs han sido el grupo de compuestos que mayor interés ha despertado porque son empleados en múltiples actividades y productos, por esa razón tienen una amplia distribución en el planeta, algunos son extremadamente tóxicos y la mayoría son químicamente muy estables por lo tanto persisten en el ambiente por largos períodos de tiempo y son bioacumulables tanto en alimentos como en tejido adiposo de humanos y animales, de ahí la importancia de su estudio [25, 26][4]. La exposición a sustancias químicas se lleva a cabo por la actividad laboral de las personas [27], por la utilización o desecho de algunos productos tales como: combustibles, lacas, pinturas, plásticos, hules, conservadores, fumigantes, insecticidas, productos de limpieza, cosméticos y alimentos, entre otros [25, 28, 29], y son pocas las personas que tienden a percibir que esta exposición a tóxicos es perjudicial para su salud [7-9]. Las principales formas de ingreso al organismo es por inhalación del aire contaminado; por el consumo de alimentos con pesticidas; por el uso de fármacos y cosméticos, por el agua para beber o absorción dérmica [30-32]. Los efectos de la exposición a cualquier sustancia tóxica dependen de la dosis, la duración, la manera en que las personas están expuestas, sus hábitos y características genéticas, así como de la presencia de otras sustancias químicas [33].

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Cáncer de mama Es una enfermedad multifactorial dependiente de hormonas con una clara relación positiva a las altas concentraciones endógenas de estrógeno[34]. Representa una proliferación maligna de células epiteliales que revisten los conductos o lobulillos mamarios [35].

Fig. 4. Mamografía

Las mamas, están formadas por tejido glandular (tejido conectivo) así como por tejido graso; del 70 al 80 % del peso total de la mama corresponde al tejido adiposo. En la mama se encuentran las glándulas productoras de leche[36] (lobulillos); las cuáles se encuentran en el tejido de sostén donde también se localizan los conductos, los vasos sanguíneos y los linfáticos. Estos últimos, transportan el líquido linfático cuyo contenido principal son proteínas y células del sistema inmunológico las cuales son llevadas a los ganglios linfáticos

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axilares ubicados sobre la clavícula y otros lo conducen a los ganglios mamarios internos ubicados cerca del esternón[36]. Al igual que otras neoplasias malignas, el cáncer de mama se inicia cuando una célula normal escapa a los controles habituales de replicación y se multiplica sin control. Esta evasión requiere de una acumulación de mutaciones en los genes que regulan la división celular y aseguran la síntesis y replicación del ADN. Ciertas hormonas y algunas sustancias tóxicas pueden promover también el crecimiento celular anómalo hasta lograr el crecimiento del tumor en la mama [33]. Los tumores invasivos de mama son histológicamente heterogéneos. Los tipos de cáncer de mama se clasifican histológicamente en carcinoma ductal in situ, carcinoma ductal infiltrante (o invasivo), casi el 80% de los casos de cáncer de mama son de este tipo; carcinoma lobular in situ; carcinoma lobular infiltrante (o invasivo), este tipo de cáncer se presenta en el 15% de las mujeres que desarrollan cáncer de mama; y carcinoma inflamatorio,se observa en cerca del 3% de los casos; entre otros subtipos raros (cuadro 1)[37, 38]. Cuadro 1. Clasificación del carcinoma mamario de acuerdo a la OMS [37, 38] Tipo de tumor No infiltrante

Invasor

Clasificación Carcinoma lobulillar in situ Carcinoma ductal in situ Carcinoma ductal invasor no específico (NST) Carcinoma ductal invasor con extenso componente intraductal Carcinoma ductal invasor con enfermedad de Pager Carcinoma lobulillar invasor Carcinoma medular Carcinoma muscinoso o coloide Carcinoma papilar Carcinoma tubular Carcinoma adenoide quístico Carcinoma secretor (juvenil) Carcinoma apócrifo Carcinoma con metaplasma Tipo escamoso Tipo células fusiformes Tipo cartilaginoso y óseo Tipo mixto Carcinoma inflamatorio

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En general, el cáncer de mama se estratifica utilizando las directrices del Comité Conjunto Americano del Cáncer (American Joint Committee on Cancer –AJCC-) conocida como clasificación TNM [39-41]. La clasificación para los subgrupos se realiza con números que van del I al IV [39-41]. Los índices de supervivencia relativa a cinco años, según el estadio del cáncer son los siguientes: I-98%, IIA-88%, IIB-76%, IIIA-56%, IIIB-49% y IV-16%[35].

Signos y síntomas del cáncer de mama El indicio más común de cáncer de mama, es la presencia de una protuberancia en el seno, dura y fija. En casi la mitad de todos los casos esas protuberancias suelen crecer cerca de los ganglios de la axila, en la parte superior y externa de la mama; las cuales pueden llegar a distorsionar la forma del seno haciéndolo parecer más grande o elevado, dándole un aspecto asimétrico con respecto al otro seno [42]. El pezón de la mama afectada puede verse escamoso o reseco, retraído o incluso sumido. En ocasiones puede presentarse salida de líquido por el pezón, de color amarillento semi traslúcido o con sangre [43]. La piel de la mama también puede verse afectada observándose acartonada y con pequeños hoyitos, similar a la de una cáscara de naranja. Otras señales que podemos observar es inflamación, enrojecimiento, irritación, descamación o grietas en la piel de la mama o del pezón, dolor en el pezón o en el brazo. Así mismo pueden presentarse punzadas o piquetes que llegan desde los hombros hasta el pezón o que se inician en el pezón y se profundizan dentro de la mama en los conductos lactíferos [43].

Epidemiología de cáncer de mama Actualmente, el cáncer de mama es la neoplasia que con mayor frecuencia se diagnostica en las mujeres, representa 15% de todos los tipos de 13



cáncer [3] es la segunda causa de muerte por cáncer en mujeres a nivel internacional (las 411,000 muertes anuales representan el 14 por ciento de muertes femeninas por este tipo de cáncer) [44]. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) en el año 2005 murieron 58 millones de personas en todo el mundo, de las cuales casi ocho millones murieron por cáncer, y se estima que en el año 2015 aumentará a nueve millones y para el 2030 a más de once millones de fallecimientos por cáncer.[45-47].

Cuadro 2.Principales causas de muerte en México 2005-2030. Fuente OMS

De acuerdo al Registro Nacional de Cáncer, se ha estimado que en México cada día mueren diez mujeres por cáncer de mama y una de cada ocho mujeres lo desarrolla; por tal razón, en algunos estados del país esta es la principal causa de muerte de mujeres en edad reproductiva (entre 15 y 64 años), 47 por ciento del total de muertes ocurre en mujeres entre 45 y 64 años, debido a que el riesgo aumenta con la edad, como sucede con cualquier tipo de cáncer[48].

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Tan sólo en el 2005, a nivel nacional se registraron 2,861 fallecimientos de mujeres por cáncer de mama, lo que representa el 21 por ciento de las muertes de mujeres por cáncer, comparado con el 19 por ciento que murieron por cáncer cérvico-uterino. La incidencia de cáncer de mama se ha incrementado en México año tras año. Según el Sistema Nacional de Información en Salud (SINAIS), en el año 2000 se registró una incidencia de 10,758 y se tiene una estimación de 19,811 para el año 2012; esto representa un incremento anual del 1 por ciento en promedio[47]. La tasa de mortalidad por cáncer de mama en mujeres mexicanas se estimó en 14.7 por 100 mil mujeres mayores de 25 años, con una sobre vida de 38 por ciento dentro de los primeros cinco años después de haberse establecido el diagnóstico y de 22 por ciento en los diez años posteriores al diagnóstico[4].

Factores de riesgo para cáncer de mama Cuando el organismo funciona adecuadamente, es capaz de reconocer microorganismos, virus o células que están dañadas o células tumorales, y los destruyen para controlar las infecciones o el crecimiento de tumores[43, 49]. Los principales factores de riesgo para desarrollar cáncer de mama son factores de tipo genético, principalmente mutaciones en los genes p53, BRCA1, BRCA2, Her2, Her2Neu, otros son de tipo reproductivo, una menarca temprana (antes de los 12 años), menopausia tardía (después de los 52 años), uso de hormonas exógenas (contraceptivos orales, terapia de hormona de reemplazo), edad del primer embarazo a término (después de los 30 años), nuliparidad, ausencia de lactancia materna, pero también existen otros factores como malos hábitos en la alimentación como exceso de grasas de origen animal, pobre ingesta de antioxidantes o vitaminas de origen vegetal, ciertas adicciones como alcoholismo o tabaquismo y drogadicción, y otros factores de tipo ambiental como

exposición

laboral

a

tóxicos

contaminadas[50]. 15

o

residencia

en

áreas

altamente



Dos tipos de cambios en el genoma son la acumulación de mutaciones somáticas y el desarrollo de inestabilidad genética. Muchos tipos de cáncer tienen un mayor número de mutaciones comparado con las células normales. Existe una correlación directa entre la progresión del tumor y el número de mutaciones. La mutación de genes reparadores conduce a un aumento en el daño del ADN y con esto también se incrementa la tasa en que las mutaciones pueden ocurrir. La inestabilidad genética está reflejada en cambios en el número de genes en células cancerosas. Esto puede ser el resultado de pequeñas duplicaciones o deleciones, translocaciones de material de un cromosoma a otro o incluso cambios que afectan a cromosomas completos. La inestabilidad cromosómica puede ser causada por complejos o proteínas que actúan en la partición (anafase) durante la mitosis (cuadro 2) [51]. Los factores genéticos, incluyendo los genes de mayor susceptibilidad, pueden explicar hasta el 10% de los casos de cáncer de mama en países desarrollados [22, 52], pero su prevalencia en la población es demasiado baja para explicar el aumento del uno por ciento anual sostenido a lo largo de los últimos 20 años a nivel internacional. Por lo que se cree, que la mayoría debe ser por lo tanto, una consecuencia a diversas exposiciones ambientales [5], [8, 27, 53]. De hecho recientemente se ha sugerido que el residir cerca de una zona industrial y estar expuesto a las sustancias contaminantes del ambiente que derivan de los procesos industriales puede ser la causa potencial del aumento en las tasas de incidencia de cáncer de mama y de la posible variación en las tasas alrededor del mundo [6]. Investigaciones recientes han demostrado que los factores ambientales pueden desempeñar un papel importante en la etiología de algunos tipos de canceres tales como tumores malignos en mama o próstata[4, 29, 49, 54].

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Factores de riesgo de cáncer de mama

Factores confirmados

Edad incrementada Región geográfica (EU y países del Oeste) Historia familiar de cáncer de mama Mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 Mutaciones en otros genes de alta penetrancia (p53, ATM, NBS1,LKB1) Exposición a radiación ionizante (en la niñez) Historia de enfermedad de mama benigna Edad tardía de menopausia (mayor de 54 años) Edad tardía de menopausia (mayor de 54 años) Edad temprana de menarca (menos de 12 años) Nuliparidad y edad avanzada en el primer embarazo a término Alta densidad en tejido mamario Terapia de remplazo hormonal Uso prolongado de anticonceptivos orales Obesidad en mujeres post-menopáusicas Consumo de alcohol (una copa por día)

Estatura alta Altos niveles de factor de crecimiento parecido a insulina 1 (IGF1) Altos niveles de prolactina Factores probables Consumo de grasas altamente saturadas Polimorfismos en genes de baja penetrancia Alto status socioeconómico Factores de riesgo de cáncer de mama

Factores confirmados

Factores probables

Región geográfica (Asia y África) Edad temprana en el primer embarazo a término Alta paridad Lactancia (entre cuatro y seis meses de duración) Obesidad en mujeres premenopáusicas Consumo de frutos y vegetales Actividad Física Agentes quimiopreventivos Drogas anti-inflamatorias no esteroideas Polimorfismos en genes de baja penetrancia

Cuadro 3. Factores que incrementan el riesgo de cáncer de mama[50]

17

Magnitud de riesgo ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + + ++ + + + + Magnitud de riesgo ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +





JUSTIFICACIÓN

Debido a que la mayoría de las personas están expuestas a una mezcla de tóxicos presentes en el ambiente, resulta de gran importancia conocer la frecuencia de los polimorfismos que presentan los genes CYP 1A1 y 1B1 en mujeres con cáncer de mama y que han estado expuestas a tóxicos en forma más prolongada o por más tiempo.

Si se encontrara que alguno de los

polimorfismos es más frecuente que otros, podría ser factible considerarlo en la estimación de riesgo para desarrollar este tipo de cáncer en mujeres, posteriormente está información sirva de base para realizar estudios ulteriores que permitan contribuir a la información de toxicidad de ciertas sustancias.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Si se considera que de los genes en p450 CYP 1A1 y CYP 1B1, codifican para las enzimas involucradas en el metabolismo de ciertos tóxicos [2], resulta importante conocer las frecuencias de los polimorfismos de estos genes en mujeres con cáncer de mama.

PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

¿Cuál de lospolimorfismos que presentan los genes CYP 1A1 y 1B1 será más frecuente en mujeres que han desarrollado cáncer de mama?

19



HIPÓTESIS DE TRABAJO

Algunos de los polimorfismos que se presentan en los genes CYP 1A1 y 1B1, entre ellos Ile462Val y Val432Leurespectivamente, están asociados al cáncer de mama.

OBJETIVOS DE INVESTIGACIÓN OBJETIVO GENERAL 

Identificar y estimar la frecuencia de los polimorfismosde los genes CYP 1A1 y CYP 1B1 (Ile462Val y Val432Leu, respectivamente) en mujeres que han desarrollado cáncer de mama y en un grupo de referencia, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

OBJETIVO PARTICULAR Identificar y describir las frecuencias genotípicas y alélicas para los polimorfismos Ile462Val y Val432Leu, en los genes CYP 1A1 y CYP 1B1.

20



MATERIALES Y MÉTODOS Diseño del estudio. Transversal. Universo de trabajo Mujeres con Cáncer de Mama, que fueron pacientes de diferentes Hospitales o Institutos, tales como la Unidad Médica de Alta Especialidad No. 145 (UMAE); Hospital de Especialidades; del Centro Médico Nacional de Occidente del IMSS, así como del Hospital Civil, Fray Antonio Alcalde en Guadalajara, Jalisco y del Instituto de Cirugía Reconstructiva; ambos de la Secretaría de Salud.

Tamaño de Muestra Se considero todas las muestras de sangre periférica de pacientes con diagnóstico

de

cáncer

de

mama

reciente

o

que

tuvieron

cáncer,

correspondientes al período del 1 de enero del 2009 al 31 de diciembre del 2009, de acuerdo a los criterios de inclusión. El número total de muestras seleccionadas fueron 151. De las cuales 76 pertenece a muestras de sangre periférica de pacientes con cáncer de mama, y 75 a muestras referencia de sangre periférica de individuos del banco de sangre de Centro Médico Nacional de Occidente (CMNO).

21



Descripción de grupos de estudio

Casos con cáncer de mama. Pacientes que mediante ecosonograma de mamas o mamografía presenten cáncer de mama con diagnóstico confirmado mediante biopsia.

Referencia. Individuos pertenecientes a población en general de los cuales se desconozcan sus datos clínicos, antecedentes personales y familiares. Este grupo se consideró para establecer parámetros

poblacionales de los

polimorfismos que se seleccionaron en el presente proyecto.

CRITERIOS DE SELECCIÓN Criterios de inclusión (pacientes) 

Mujeres con diagnóstico reciente o que tuvieron cáncer de mama.



Derechohabientes de la Unidad Médica de Alta Especialidad No. 145 (UMAE);

Hospital

de

Gineco-obstetricia;

Instituto

de

Cirugía

reconstructiva y; Hospital Civil; Guadalajara, Jal.

Referencia: 

Individuos que acudieron al Banco de sangre del CMNO, como donadores, de quienes se desconocen sus datos clínicos, antecedentes personales y familiares.

Criterio de exclusión Muestra de sangre insuficiente, sea perdida involuntariamente, se degrade o contamine, antes o durante todos los procedimientos del análisis molecular.

22



VARIABLES Variable dependiente Polimorfismos encontrados de los genes CYP1A1 Y CYP1B1.

Polimorfismo: variación en la secuencia de un lugar determinado del ADN entre los individuos de una población. Polimorfismos Gen CYP1A1: Ile462Val Polimorfismos Gen CYP1B1: Val432Leu

Variable independiente Como variable independiente se considerará el diagnóstico de cáncer de mama. Cáncer de mama: Proliferación acelerada, desordenada y no controlada de células con genes mutados, los cuales suprimen o estimulan la continuidad del ciclo celular pertenecientes a distintos tejidos de una glándula mamaria.

Cuadro de Operacionalización de variables Variable

Interrelación

Naturaleza

Medición

Análisis

Nominal Polimorfismos

Dependiente

Cualitativa

CYP1A1 (Ile462Val) y

Dicotómica

Chi

(ausente/presente)

cuadrada

CYP1B1 (Val432Leu) Nominal Cáncer de mama

Independiente

Cualitativa

23

Dicotómica

Chi

(ausente/presente)

cuadrada



Descripción de las Técnicas Extracción de ADN. Se obtuvieron muestras de sangre periférica de pacientes con cáncer de mama. Se llevó a cabo la extracción de ADN de cada muestra mediante protocolos previamente descritos. La sangre periférica (5 mL) se colectó en tubos con EDTA como anticoagulante y la extracción de ADN se realizó por el método Miller. La integridad y pureza se determinó mediante espectrofotometría y electroforesis en gel de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etidio. Todas las muestras una vez cuantificadas se ajustaron a 100 µg/mL para utilizarlas en los procedimientos moleculares.

Macrométodo de Miller Tipo de muestra: Sangre periférica.

Reactivos Necesarios: 

Solución buffer de lisis



Solución B



SDS



Proteinasa K



NaCl 6M



Etanol 100%



Etanol 70%



TE

24



Preparación de reactivos

Solución buffer de lisis Pesar 15.4 gr. de cloruro de amonio (NH4Cl) 0.44M y aforar en 2 Lt de agua destilada. Pesar 0.158 gr. de bicarbonato de amono NH4NCO3 0.01M.e hidratar en 200 mL de la solución de NH4Cl

144 M mezclar y agregar al matraz de la primera

solución aforar a 2 Lt.

Solución B Miller. Sustancias. Mili

pH

Gramos

7.5

0.6055

moles Tris base

10 mM

NaCl

40 mM

EDTA

2 mM

11.688 8.0

0.3722

 En un Vaso 1000 mL colocar un agitado magnético  Vaciar 350 mL de agua bidestilada  Agregar el tris base ya que esté disuelto agregar en NaCl y al final el EDTA  Ajustar pH a 8.2 (con HCl diluido)  Vaciar a un matraz de 1000 mL llevar a esterilizar  Posteriormente vaciarlo a un matraz volumétrico de 500 mL y aforar con agua destilada estéril, mezclar y almacenar.

SDS al 20%. Pesar 5 gr. de SDS y disolver en 25mL de agua destilada. 25



Proteinasa K Reactivo

Gramos

Proteinasa K

0.050

SDS

0.5

EDTA

0.0372

Aforar a 50 mL para 100 muestras. Colocar un agitador magnético limpio poner 35 mL de agua des-ionizada estéril colocar el vaso en un plato con agitador agregar primero el EDTA, ya que esté disuelto, vaciar el SDS (agitar suavemente cuidando que no se forme espuma), agregar la proteinasa K hasta que se disuelva, vaciar a un tubo de 50 mL y aforar. *Cubrir de la luz con papel aluminio.

NaCl 6M Pesar 35.1gr. de cloruro de sodio (NaCl) en 100 mL de agua destilada.

Etanol al 70% Tomar 35 mL de etanol al 100% y aforar con 15 mL de agua destilada estéril.

TE Reactivo

Gramos

Tris base

0.0605

EDTA

0.0186

Pesar todo en ese orden, disolver y aforar a 50 mL con H2O destilada estéril. 26



Equipo 

Centrífuga refrigerada



Incubadora



Micro centrifuga



Congelador

Procedimiento 1.- Para obtener el botón se depositarán 10 mL de sangre periférica con EDTA más solución buffer de lisis hasta aforar los tubos a 35 mL. 2.-Refrigerar por 10 minutos. 3.-Centrifugar a 3900rpm durante 15 min. 4C. 4.-Decantar y lavar el botón con un poco de solución de lisis con movimiento circular, retirar el sobrenadante y

desbaratar el botón, .después agregar

solución de lisis hasta alcanzar un volumen de 25 mL. 5.-Centrifugar nuevamente a 3900 rpm 15 min. a 4C. 6.-Decantar y guardar el botón a -20C (opcional). 7.-Se re suspenderá el botón en 3 mL de solución B (búffer de lisis de Miller). 8.-Agregar 200 L

de SDS al 10% + 500L de solución de proteinasa

K,

agitar suavemente, 15 seg. en un vórtex. .9.-Incubar 24-48 h. a 37C. 10.-Después de incubar se adicionará 1mL NaCl 6M 11.-Agitar en el vórtex durante 15 seg. 12.-Centrifugar a 3900rpm durante 15 min. a -4C. 13.-Se tendrá preparados 10 mL de etanol frió al 100% en un tubo de 15 mL, posteriormente se agrega el sobrenadante y se agita suavemente hasta precipitar. 14.- Transferir el ADN precipitado en un tubo de 1.5 mL con una pipeta y se agrega 750L de etanol al 70%. 15.-Centrifugar a 10,000 rpm de 3-5min. 1.6-Decantar el etanol 27



17.-Realizar un segundo lavado con 750L de etanol a 70%, centrifugando a 10,000 rpm durante 3min. 18.-Decantar el etanol y dejar secar a temperatura ambiente. 19.-Agregar búffer TE para re suspender el ADN.

Integridad y pureza Método Electroforesis en geles de Agarosa Equipo y Materiales  Cámara para electroforesis horizontal  Cama o soporte para hacer geles  Plancha de calentamiento  Balanza Analítica  Fuente de poder  Peine para hanchura de pozos de 8 dientes  Matraz Erlenmeyer de 100 mL  Guantes

Reactivos  Agarosa  Búffer TBE 1X  Agua Bidestilada Nota: El gel debe prepararse en el mismo búffer de corrimiento, para proporcionar las mismas condiciones en el soporte (gel) y en la fase líquida. El corrimiento se realiza a un voltaje moderado que puede ser de 65 V durante 30 min. (hasta que se separen los colorantes del búffer cargador o jugo azul) y 80 V durante 30 min, dependiendo también del tamaño del fragmento y de la cámara de electroforesis. 28



Procedimiento 1. Pesar 0.75 gr. de agarosa y agregar cuidadosamente a un matraz Erlenmeyer de 150 mL con 50 mL de TBE 1X, a pH de 8.0. Se coloca sobre la placa para calentar (o en el microondas), se espera a que comience a hervir. 2. Se agita suavemente el matraz para diluir todos los residuos de agarosa, hasta que la solución quede cristalina. 3. Revisar el volumen de la agarosa disuelta y completar (aforar) a 100 mL con TBE 1X, mezclando suavemente por agitación. 4. Lavar previamente el molde en que se vaciará el gel y la cámara de electroforesis. Poner el molde en una tabla o mesa nivelada. 5. Esperar a que la temperatura llegue aproximadamente a 55 ºC para así aplicar la agarosa en el molde, cuidando que no queden burbujas en la matriz del gel. 6. Poner el peine y esperar a que gelifique completamente, para después remover el peine cuidando de no romper los bordes de los pozos. 7. Colocar el gel en la cámara de electroforesis y adicionar TBE 1X a un pH de 8.0 observando que el nivel del búffer este aproximadamente 0.5 – 1cm por encima de la superficie del gel. 8. Colocar las muestras de ADN (previamente mezcladas sobre un parafilm con jugo azul) en los pozos del gel. La cantidad dependerá del tamaño de los pozos. 9. Conectar los cables de la fuente de poder. El voltaje debe estar en un rango de 60 a 80 V. Recordar que el ADN tiene una migración anódica: tiene carga negativa (-) y migrará hacia el cátodo (+) o polo positivo. Anotar condiciones de corrimiento para cada experimento particular.

29



Rango de separación de ADN en geles de agarosa Cantidad de Agarosa en el gen

Rango de separación efectivo de ADN en

(% [peso/volumen])

geles de agarosa

0.3

5-60

0.6

1-20

0.7

0.8-10

0.9

0.5-7

1.2

0.4-6

1.5

0.2-3

2.0

0.1-2

Método de tinción con bromuro de etidio Equipo y material  Lámpara de luz ultravioleta o transiluminador  Máscaras protectora de luz ultravioleta  Charola para colocar el gel  Gasas  Guantes

Reactivos  Solución de bromuro de etidio  Agua bidestilada

Procedimiento 1. Colocar el gel en un envase plano (preferiblemente de vidrio) con 300 mL de solución de bromuro de etidio en 300 mL de agua destilada por 515 min. 30



2. Pasar el gel a una charola con agua bidestilada por 1 ó 2 min. Según se requiera. 3. Observar el gel con el ADN en el transiluminador de luz UV utilizando la protección adecuada.

Método para cuantificación de ADN Para cuantificar la cantidad de ADN o ARN, deben tomarse las lecturas de la densidad óptica (DO) o absorbancia a 260 nm y 280 nm. La lectura a 260 nm permite calcular la concentración de ácido nucleico en la muestra. Una DO de 1 corresponde a aproximadamente 50 µg/mL de ADN de doble cadena, 40 µg/ml de ADN de cadena sencilla y ARN, y alrededor de 20 µg/mL de oligonucléotidos de cadena sencilla. La tasa entre las lecturas a 260 nm y 280 nm (DO260/ DO280) proporciona un estimado de la pureza del ácido nucleico. Las preparaciones puras de ADN o ARN tienen valores de DO260/DO280 de 1.8 y 2, respectivamente. Si hay una confirmación con proteínas o fenol, este valor será significativamente menor y no será posible la cuantificación exacta del ácido nucleico.

Procedimiento 1. Las

muestras

perfectamente

homogéneas

se

bajan

en

la

microcentrífuga. 2. Encender en el espectro la lámpara de luz UV, si es computarizada utilizar el programa para ácidos nucleicos. 3. Ajustar con el blanco el espectro, midiendo 1000 µL de agua bidestilada o inyectable en la celdilla de cuarzo para el espectrofotómetro. 4. Rotular un tubo de 1.5 mL por cada muestra. 5. Colocar 995 µL de agua MilliQ en cada tubo. 6. Adicionar 5 µL de ADN a su tubo correspondiente. 7. Para cuantificar se coloca el contenido de cada tubo en la celdilla de cuarzo, agitar perfectamente la solución y leer la muestra. 31



8. Se repiten los pasos 3 al 7 para cada muestra. 9. Registrar las lecturas de densidad óptica (DO) a 260 nm y 280 nm, para calcular la cantidad de pureza del ADN.

Fórmula para calcular la concentración del ADN Considerando que: 

50 µg/mL de ADN de doble hebra absorben 1 DO a 260 nm.



La relación de lecturas de DO 260 nm/DO 280 nm nos proporciona una estimación de la pureza de los ácidos nucleicos. Las preparaciones puras de ADN presentan valores aproximados de 1.7 a 2.0.

CONCENTRACIÓN DE ADN (µg/mL) = (DO 260nm) (Factor de dilución) (50) El factor de dilución en este caso es el volumen total de la celdilla entre el volumen de la muestra (en este caso 200/1 0 200).

Detección de polimorfismos Para la detección de los polimorfismos se diseñaron protocolos de PCR/RFLP, la descripción de cada uno se muestra en el cuadro 3.

Gen

Polimorfismo

Iniciadores

Tº de

Producto

Enzima de

Corte de

alineamiento

amplificado

restricción

Enzima

(ºC)

(pb)

F:5´GGC CCC AAC TAC TCA GAG GCT CYP1A1

(Ile462Val)

3´

56

147

55

113

MspI

C

CGG

R:5´ GC TGA GCA ATC TGA CCC TA 3´ F:5´ AAT TTC AGC TTG CCT CTT G 3´ CYP1B1

(Val432Leu)

R:5´ TCA CTT GCT TTT CTC TCT CC 3´

AcuI

CTGAAG_N(16)

Cuadro 4. Estrategias de detección de los genes de la familia CYP1. Iniciadores y enzima de restricción correspondiente para la genotipificación de cada polimorfismo.

32



Para la selección de los polimorfismos de los genes CYP1A1 Y CYP1B1 se consultó la base de datos SNP del NCBI. Se diseñaron iniciadores específicos a partir

de

la

secuencia

GenBankhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genebank

para

obtenida

del

la

de

amplificación

fragmentos de ADN que contiene a los polimorfismos seleccionados de los genes CYP1A1 Y CYP1B1 mediante el programa OligoTM v6.0. Se llevó a cabo la estandarización a partir de las condiciones de reacción mostradas en el cuadro 4 tanto para amplificación por PCR como para la reacción de digestión con enzimas de restricción mostradas en el cuadro 5 para la detección de los polimorfismos del cuadro 3. Reactivos

Concentración

µL por reacción

500ng/μL Muestra DNA 1 Iniciador 1 (foward) 15 pmol/µL 1.5 Iniciador 2 (reverse) 15 pmol/µL 1.5 dNTP´s 100nM 2 Búffer 10 x (Mg+) 1X 2.5 H²O cbp 25 µL 16.5 Taq pol 0.5 U 0.2 Volumen total por 25 tubo Cuadro 5. Condiciones de reacción para la PCR. *Mg+, mercurio *Taq pol

Reactivos

Concentración

µL por reacción

Búffer (depende de cada enzima)

1X

2

Enzima de restricción

1U

0.2

cbp 20 µL

2.8

-

15

Agua Producto amplificado Volumen final

20

Cuadro 6. Condiciones de reacción para la digestión con enzimas de restricción.

33



Técnica Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) La Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR (por sus siglas en inglés Polymerase Chain Reaction) es un método que permite la amplificación selectiva in vitro de secuencias específicas del ADN blanco a partir de una fuente heterogénea y grande como el ADN genómico.

Condiciones 95 °C/4min 95 °C/10seg 60 °C/30seg 72 °C/1 1/2min 72 °C/5min Ciclos: 35 Paso 1.-Se preparará Mix1, en un tubo estéril de 0.2 µL (en hielo) de la siguiente manera: MIX1

Volúmenes

cDNA

1.0 µL

Primer 1

1.5 µL

Primer 2

1.5 µL

H2O

1.5 µL

Σ=

5.5 µL

Paso 2.-Se preparará Mix2 cbp todas las relaciones del paso anterior en un tubo de 2 ml estéril (en hielo). Paso 3.- Agregar 15.0 µl de la Mix2 a cada tubo del paso 1 (trabajar en hielo) Paso 4.-Homogenizar cada tubo y colocar en el termociclador. 34



Descripción de enzimas de restricción

MspI Sitio de reconocimiento: C CGG GCC G Temperatura de reacción: 37 ºC Concentración: 5 U/µL46

AcuI Sitio

de

reconocimiento:

CTGAAGNNNNNNNNNNNNNNNNN

GACTTCNNNNNNNNNNNNNNNNN ... ... Temperatura de reacción: 37 º C Concentración: 10 U/µL

35

...

...



Análisis Estadístico Se realizó conteo génico para establecer frecuencias génicas y genotípicas y mediante la prueba de Χ2 de bondad de ajuste se calculó el equilibrio

Hardy-Weinberg.

Las

frecuencias

de

los

genotipos

fueron

2

determinadas por conteo genotípico y la prueba estadística fue Χ . Se calculó un Intervalo de Confianza de 95 % para las mediciones obtenidas y un valor de p < 0.05 se considero significativo.

Consideraciones éticas El protocolo de estudio fue elaborado de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana en materia de investigación en humanos y de acuerdo con las normas de bioética que establece al respecto en la Ley General de Salud de la República Mexicana haciendo hincapié en los artículos estipulados en el titulo segundo capítulo I (Art.13, 14, 15, 16). Conforme al artículo 17 el presente proyecto se encuentra en la categoría de investigación con riesgo mínimo [55]. Durante todo el estudio, se observaran los lineamientos definidos en el tratado de Helsinki y en las enmiendas realizadas a éste, en Tokio, en relación con la realización de investigación en humanos [56].

36



RESULTADOS Población estudiada Se captaron un total de 151 muestras de sangre periférica que se clasificaron en 76 casos (con cáncer de mama) y 75 individuos de referencia (población

general)

para

establecer

parámetros

poblacionales

de

los

polimorfismos.

Análisis Molecular

Las figuras 4 y 5 muestran la amplificación y digestión del polimorfismo Ile462Val del gen CYP1A1. El fragmento amplificado tiene un tamaño de 147 pb. En la digestión con la enzima MspI se observaron dos bandas de 90 y 61 pb.

147 pb

Figura 5. Producto amplificado del polimorfismo Ile462Val del gen CYP1A1. Gel de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etidio. El producto amplificado observado en todos los carriles es de 147 pb, M: escalera de 100 pb.

37



Figura 6. Producto digerido del polimorfismo Ile462Val del gen CYP1A1. Gel de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etidio. Se observan dos bandas de 90 y 61 pb. Genotipos en números negros: genotipo 1, Ile/Ile (carriles 1,3,5,6,7), genotipo 2, Ile/Val (carriles 2,4,8,9,10,11,13) y genotipo 3, Val/Val (carril 12).

Se detectó el polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1 al amplificar un producto de 113 pb y digestión de este con la enzima AcuI donde se observaron dos bandas de 95 y 75 pb lo que se muestra en las figuras 6 y 7.

Figura 7. Producto amplificado del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1. Gel de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etidio. El producto amplificado observado en todos los carriles es de 113 pb, M: escalera de 100 pb.

38



Figura 8. Producto digerido del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1. Gel de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etidio. Genotipos en números negros: genotipo 1, Leu/Leu (carril 1), genotipo 2, Leu/Val (carriles 4,5) y genotipo 3, Val/Val (carril 3).

Análisis estadístico Mediante conteo génico se realizó la determinación de la frecuencia de los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1 Y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama. Se determinó la frecuencia de los polimorfismos mencionados en población en general (referencia) para determinar si los genotipos

se

encontraban

en

equilibrio

polimorfismos no han sido analizados

Hardy-Weinberg,

ya

que

los

en población Mexicana por lo que se

desconocen sus frecuencias en ésta. El polimorfismo que mayormente se presentó fue Ile462Val del gen CYP1A1 en 51 casos de mujeres con cáncer de mama (67.1%) y en 44 muestras de la población de referencia (58.6%) a diferencia del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1 que se presentó sólo en 25 casos de mujeres con cáncer de mama (32.9%) y en 31 de las muestras de referencia (41.3%). La frecuencia de los polimorfismos analizados en los grupos cáncer de mama y en la población de referencia se muestra en el cuadro 6 y 7. 39


Polimorfismo

Ile462Val

Leu432Val


Genotipos

Ca mama

Referencia

Casos (porcentaje)

Casos (porcentaje)

AA

10 (19.60)

13 (29.54)

AG

18 (35.29)

11 (25)

GG

23 (45.09)

20 (45.45)

Total

51

44

GG

7 (28)

10 (32.25)

GC

10 (40)

12 (38.70)

CC

8 (32)

9 (29.03)

Total

25

31

Cuadro 7. Frecuencia genotípica de los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1 y CYP1B1, en grupo con cáncer mama y de referencia.

Polimorfismo

Ile462Val

Leu432Val

Alelos

Ca mama

Referencia

Casos (porcentaje)

Casos (porcentaje)

A

37 (36.27)

29 (32.95)

G

65 (63.72)

59 (67.04)

Total

102

88

G

17 (34)

42 (67.74)

C

33 (66)

20(32.25)

Total

50

62

Cuadro 8. Frecuencia alélica de los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1 y CYP1B1, en grupo con cáncer de mama y de referencia.

Los genotipos de los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1 Y CYP1B1, se encuentran en equilibrio Hardy-Weinberg. Las consideraciones estadísticas entre los grupos se describen en el cuadro 8. 40



Polimorfismo

Ca mama

Referencia

Ile462Val

Χ2=2.5851

Χ2= 0.4084

P= 0.0582

P=0.4152

Leu432Val

2

Χ =1.1918

Χ2=1.8476

P=0.5494

P=0.3970

Cuadro 9. Determinación de equilibrio Hardy-Weinberg de la distribución de los genotipos de los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en los grupos de estudio.

La determinación de la prueba de chi cuadrada y el valor de p de los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1 y CYP1B1 se describen en el cuadro 9.

Polimorfismo

Ca mama %

Referencia %

Ile462Val

67.10

58.66

Leu432Val

32.89

41.33

Χ2 = 0.47870634 P = 0.7921

Χ2 = 0.67709214 P = 0.2785

Cuadro 10. Determinación de chi cuadrada y valor de p en los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1 y CYP1B1.

41



Las frecuencias genotípicas y alélicas para los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1 Y CYP1B1 se muestran en la figura 8 y 9 respectivamente.

Figura 9. Frecuencias genotípicas y alélicas del polimorfismo Ile462Val del gen CYP1A1 en grupo con cáncer de mama y de referencia

Figura 10. Frecuencias genotípicas y alélicas del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1 en el grupo con cáncer de mama y grupo de referencia

42



DISCUSIÓN En mujeres, el cáncer de mama es una de las principales causas de muerte. La complicación más frecuente es la invasión, la cual puede presentarse por un gran número de factores entre los cuales están un diagnóstico tardío o erróneo, antecedentes familiares y la susceptibilidad personal hacia la metástasis. En la bibliografía internacional numerosos estudios describen y clasifican los genes que intervienen o participan en el cáncer de mama. El presente estudio analiza los genes que se asocian al incremento del riesgo de cáncer de mama mediante la identificación de genotipos particulares. Los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1 y CYP1B1 respectivamente, no han sido analizados en población Mexicana, únicamente se han estudiado en población Caucásica y China pero con asociación a otro tipo de cáncer como el de pulmón. Existen varios factores que pueden alterar no sólo la producción, sino también la exposición a las hormonas endógenas, como la edad de la menarquía, edad del primer embarazo a término, número de embarazos y la edad de la menopausia, y muchos de estos factores tienen un efecto adicional en el riesgo de desarrollar cáncer de mama[5, 34, 57]. Por lo tanto, los genes implicados en el metabolismo de las hormonas sexuales son candidatos a genes de susceptibilidad para desarrollar cáncer de mama. Los genes que están en la ruta de biosíntesis de hormonas sexuales pueden afectar la síntesis y el periodo de exposición del estrógeno más activo, el estradiol. Los genes que se encuentran en esta vía son los de la familia de CYP.[45, 46] En este estudio nosotros consideramos importante estudiar estos genes debido a que muchos tóxicos ambientales tienen la capacidad de ingresar al organismo y competir por el sitio activo del receptor a estrógeno con lo cual sin tener una naturaleza de hormona, se comportan como tal y pueden ejercer algunas de las 43



funciones que se han descrito para las hormonas, en particular, para los estrógenos, como son la capacidad de incrementar el índice mitótico en muchos tipos de células, pero algunos tóxicos adicionalmente también pueden inducir mutaciones e inmunosupresión[4, 58]. Por esta razón muchos hidrocarburos han sido llamados xenoestrógenos y han sido asociados al incremento del riesgo para desarrollar algunos tipos de tumores malignos, en especial aquellos que son de tipo hormono-dependiente como es el cáncer de mama o el de próstata [29, 49, 58]. En particular la CYP1A1 es una enzima extrahepática. Su expresión constitutiva es muy baja, pero es muy inducible por ligandos del receptor Ah (hidrocarburos aromáticos policíclicos, dioxinas, humo del tabaco y otros xenoestrógenos) por lo que la exposición a estos compuestos aumenta de forma significativa sus niveles en tejidos como el pulmón, la placenta, la glándula mamaria o los linfocitos [10, 11, 59]. En otras poblaciones estudiadas anteriormente algunas de las variantes polimórficas, se han relacionado con una mayor incidencia del cáncer de pulmón en algunos grupos de población, sin embargo no había evidencia de un riesgo mayor de desarrollar cáncer de mama entre las mujeres que presentaban alguna de las variantes polimórficas de los genes CYP1A1 o CYP1B1. [12, 20, 60] Ningún reporte anterior demostró un aumento de riesgo de cáncer de mama asociado con algún polimorfismo en particular de estos genes. Sin embargo, se publicó recientemente un meta-análisis que informó de un OR de 0.91 (IC 95% 0.79, 1.04) asociado con la condición de ser heterocigoto Asn/Ser y un OR de 0.85 (95% IC 0,54, 1,34) asociado con la condición de ser homocigoto Ser/Ser para estos genes y un riesgo mayor para desarrollar cáncer de mama[23]. Esto es importante debido a algunas variantes polimórficas de los genes CYP1A1 y CYP1B1 han mostrado ser funcionalmente más eficientes en su actividad catalítica para la conversión de estrógeno a 4-hidroxi-estrógeno 44



y de algunos tóxicos en compuestos menos agresivos, por medio de procesos de metilación, así como diferentes respuestas ante la exposición a tóxicos y niveles de daño al ADN, este mecanismo puede ser el más relevante en la presentación de una enfermedad benigna del tejido mamario y su progresión hasta cáncer de mama, incluso con la formación de metástasis[61-63].

Nuestros resultados mostraron que el polimorfismo que mayormente se presentó fue Ile462Val del gen CYP1A1 en 51 casos de mujeres con cáncer de mama (67.1%) y en 44 muestras de la población de referencia (58.6%) con un valor de p=0.7921; a diferencia del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1 que se presentó sólo en 25 casos de mujeres con cáncer de mama (32.9%) y en 31 de las muestras de referencia (41.3%) con un valor de p=0.2785.

Consideramos que pese a que nuestra muestra fue pequeña, la diferencia que encontramos puede sugerir que debido a que las enzimas CYP1A1 y CYP1A2 juegan un papel importante en la activación de algunos procarcinógenos, convirtiéndolos en metabolitos intermediarios que pueden unirse al ADN originando mutaciones[1],y que la CYP1A1 activa el beno(a)pireno y otros hidrocarburos aromáticos policíclicos, y participa fundamentalmente en la activación de nitrosaminas, aflatoxina B1 y aminas aromáticas[59, 64], con las cuales muchas personas tienen exposición no sólo por actividad laboral o por lugar de residencia, sino también por tóxicos que son ingeridos en los productos para la alimentación o para uso domestico, y es muy posible que la variante polimórfica que nosotros encontramos como más frecuente, no sea la más apta para el adecuado metabolismo de los tóxicos y que muchas de las mujeres que desarrollaron este tipo de tumor hubieran sido susceptibles por esta deficiencia en esta enzima. En el caso del CYP1B1 que también se expresa de forma constitutiva en el riñón, próstata, glándula mamaria o el ovario, pero no en el hígado [12, 61]. Y que en general su expresión basal (en situaciones de no inducción) es mayor que la del CYP1A1 y que participa tanto en el metabolismo de estrógenos como 45



de hidrocarburos aromáticos policíclicos y de aminas heterocíclicas [19, 22, 61, 62]. Para este gen del CYPlB1 se han descrito diferentes variaciones alélicas algunas de las cuales se traducen en una alteración funcional [22, 63]. Se ha sugerido un posible papel del enzima como modulador de ciertos procesos de crecimiento y diferenciación, así como una sobreexpresión del mismo en algunos tumores[12, 62]. Sin embargo, en este estudio nosotros observamos que esta variante Leu432Val del gen CYP1B1 (32.9%) que fue encontrada para esta población estudiada no fue significativamente diferente a la reportada para la variante Ile462Val del gen CYP1A1(67.1%), lo cual podría tener explicación en el tipo de agentes tóxicos a los que estuvieron expuestas estas pacientes o sus factores de exposición a estrógenos endógenos que pudieron jugar un papel importante como ya lo hemos mencionado. Es importante señalar que las limitantes principales de este estudio fue el de encontrar personas que de acuerdo a los criterios de inclusión desearan participar en el estudio, lo cual redujo nuestro universo de trabajo. Sin embargo, aun cuando nuestra población de estudio fue pequeña la posibilidad de identificar la frecuencia de los polimorfismos de los genes de la familia CYP1 fue importante debido a que podría ser factible considerarlo en la estimación de riesgo para desarrollar cáncer de mama y para contribuir a la información de toxicidad de ciertas sustancias.

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CONCLUSIONES Los resultados del presente estudio indican una clara diferencia en la frecuencia de los polimorfismos Ile462Val del gen CYP1A1 en 51 casos de mujeres con cáncer de mama (67.1%) y en 44 muestras de la población de referencia (58.6%) a diferencia del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1 que se presentó sólo en 25 casos de mujeres con cáncer de mama (32.9%) y en 31 de las muestras de referencia (41.3%). Siendo el polimorfismos del gen CYP1A1 el que con mayor frecuencia se observó en el grupo con cáncer de mama, a diferencia del grupo tomado como referencia.

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PERSPECTIVAS La identificación y estimación de la frecuencia de los polimorfismos de los genes de la familia CYP1, es importante

debido a que podría ser factible

considerarlo en la estimación de riesgo para desarrollar cáncer de mama y para contribuir a la información de toxicidad de ciertas sustancias. Es necesario hacer un estudio con un mayor tamaño de muestra, ya que el análisis estadístico puede encontrarse en el límite de la diferencia significativa, por el reducido número de individuos analizados debido a las dificultades técnicas para conseguir muestras. El cáncer de mama es una enfermedad heterógenea debido a sus múltiples formas de presentación, es por esto que es importante realizar otros estudios que permitan determinar la distribución de los polimorfismos en todo el país, así como su interacción con otros factores tanto genéticos como ambientales

Es el primer estudio en nuestro conocimiento que realiza una estimación de la frecuencia de los polimorfismos presentados asociados con el incremento del riesgo para cáncer de mama en población Mexicana. Es necesario incrementar el número de polimorfismos de los genes estudiados para poder analizar de qué manera contribuyen al desarrollo de este tipo de tumor y de esta forma poder considerarlo, en un futuro, en la estimación de riesgo.

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ANEXOS





Anexo I. Carta Consentimiento Informado Guadalajara, Jalisco a _____de_____del 200_ A quien corresponda: Por este medio comunico que se me ha informado con detalle, los objetivos, alcances y beneficios del proyecto de investigación “Frecuencia de los polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con Cáncer de Mama”, en el cual deseo participar libre y voluntariamente. Se me ha explicado claramente que mi participación consiste, en permitir que el personal responsable del proyecto, me realice preguntas para la elaboración de mi historia clínica, que me tomen muestras de sangre, en las fechas que se me indique. Asimismo estoy informada que voy a recibir los resultados de mis estudios y que puedo solicitar mas información si tuviera alguna duda en cuanto a ellos. Se me ha indicado también, que puedo dejar de participar en el proyecto en el momento en que yo así lo desee y que esta decisión no tendrá ninguna consecuencia negativa para mí, ni para recibir la atención médica que requiera. ____________________________________ Nombre y firma del participante Domicilio ____________________________ Teléfono

____________________________

____________________________

_________________________

Nombre del Testigo

Firma del Testigo

____________________________

______________________________

Investigador Responsable Dra. Ruth De Celis Carrillo

Biol. Laura Janin Muñoz Islas

Lab. de Oncología Ambiental

Lab. Oncología Ambiental

División de Inmunología, CIBO, IMSS

División de Inmunología, CIBO, IMSS

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